Tekst źródłowy strony Metody Biofizyki Molekularnej/Ultrawirowanie analityczne

Ultrawirowanie analityczne należy do grupy technik umożliwiających badanie zachowania się makrocząsteczek w roztworze. Podczas ultrawirowania analitycznego biomolekuły są charakteryzowane w stanie natywnym w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, bez zaburzających oddziaływań ze złożami.
==Zjawisko sedymentacji==
W trakcie ultrawirowania biomolekuł zachowują się podobnie jak cząsteczki zawiesin makroskopowych w procesie sedymentacji, czyli '''osiadania w polu grawitacyjnym wywołanego różnicą gęstości fazy rozproszonej i ośrodka dyspersyjnego'''.

Proces sedymentacji zawiesin makroskopowych w polu grawitacyjnym wygląda następująco:
*bezpośrednio po zakończeniu mieszania stężenie zawiesiny  jest jednakowe w każdym naczyniu,
*na skutek opadania cząstek zawiesiny górna część płynu nie zawiera zawiesiny, a na dnie pojawia się osad,
*w miarę upływu czasu granica ta przesuwa się ku dołowi, rośnie również grubość osadu na dnie,
*proces osiadania cząstek można przyspieszyć poprzez wirowanie.

Na szybkość sedymentacji ma wpływ: 
*różnica gęstości pomiędzy cząstkami zawiesiny a cieczą,
*lepkość płynu decydująca o tarciu pomiędzy cząstkami zawiesiny a płynem.
W przypadku zawiesiny makrocząsteczek biologicznych w polu grawitacyjnym nie obserwujemy zjawiska sedymentacji. Dopiero gdy poddamy próbkę działaniu sił odśrodkowych setki lub tysiące razy większych niż siła grawitacyjna przeciwdziałających siłom wyporu, dyfuzji i flotacji, ulegają one osadzaniu.

==Historia==
W 1877 roku szwedzki inżynier, Gustaf Carl de Laval wynalazł ręczną wirówkę do uzyskiwania śmietany z mleka i  następnie opatentował wynalazek.

W 1908 roku Perrin odkrył zjawisko równowagi sedymentacyjnej w roztworach cząstek gumiguty, rozdzielanych wg rozmiarów poprzez uważne wirowanie, a w 1909 roku opublikował pracę o wyznaczeniu liczby Avogadro metodą pomiarów dyfuzji mikrocząstek. W 1926 roku otrzymał Nagrodę Nobla "for his work on the discontinuous structure of matter, and especially for his discovery of sedimentation equilibrium".

Ultrawirówka zbudowana  przez Theodora Svedberga (lata 1920-ste) okazała się jednym z najbardziej owocnych, odpowiednich urządzeń do badań makromolekuł. Svedberg udowodnił, że białka składają się z dużej liczby atomów połączonych wiązaniami kowalencyjnymi i w 1926 roku otrzymał Nagrodę Nobla w zakresie chemii za prace nad układami rozproszonymi.

W 1923 roku pojawiła się  pierwsza wirówka z optycznym systemem detekcji.

W 1926 roku wykonano pierwszy pomiar masy cząsteczkowej hemoglobiny i ovalbuminy metodą równowagi sedymentacyjnej.

W 1929 roku Ole Lamm podał równanie opisujące przesuwanie się granicy w polu siły odśrodkowej.

W latach 30-tych XX wieku skonstruowano system optyczny umożliwiający obserwacje gradientu stężenia w funkcji odległości w kuwecie pomiarowej i powiązano parametry wirowania z kształtem i uwodnieniem makrocząsteczek.
Od lat 40-tych do końca 60-ych udoskonalano urządzenie, lata 70-te nazwano „złotymi latami” tej techniki pomiarowej.

Z kolei w latach 80-tych ultrawirowanie zaczęło traci popularność ze względu na zastosowanie elektroforezy i chromatografii żelowej wymagających mniejszych ilości materiału, oraz trudną analizę danych na wolno pracujących komputerach.

W latach 90-tych wprowadzono nowy model ultrawirówki, zautomatyzowano sposób zbierania danych i ich analizy. Zainstalowano dwa systemy detekcji (rozpraszanie i absorpcja) w jednej wirówce. 

Od 2000 roku ultrawirowanie analityczne przeżywa renesans. Stosuje się je w przypadku różnych badań (czystość próbki, masa, kształt, oddziaływanie z innymi makromolekułami) dla obiektów o szerokim zakresie mas cząsteczkowych (od kilkuset do dziesiątek milionów). 

==Podstawy fizyczne ultrawirowania analitycznego==

Podczas wirowania z prędkością kątową ω na cząsteczkę o masie m działają następujące siły:

<ol><li>siła odśrodkowa  <br/>
:<math>F=m\omega 2r=ma=V\rho a</math><br/>
gdzie: r – odległość od osi obrotu, a- przyspieszenie odśrodkowe, V – objętość cząsteczki, &rho; – gęstość cząsteczki. 
<li>tarcie dynamiczne  <br/>
:<math>T=f\left(\frac{\mathrm dr}{\mathrm dt}\right)</math><br/>
gdzie: ''f'' – współczynnik tarcia, zależny od właściwości cząsteczki oraz lepkości roztworu
<li>siła wyporu <br/>
:<math>W=V\rho_s \omega 2r= V\rho_sa=\frac{ma\rho_s}\rho</math><br/>
gdzie: <math>\rho_s\;</math> &mdash; gęstość cieczy.<br/>
Warunek równowagi: cząsteczka porusza się ruchem jednostajnym jeśli siła tarcia i siła wyporu równoważą siłę odśrodkową <br/>
<math>F + W + T = 0\;</math><br/>
<math>V(\rho-\rho_s)\omega^2r =f\frac{\mathrm dr}{\mathrm dt}F-W</math><br/>
czyli:<br/>
<math>V\rho\left(1-\frac{\rho_s}\rho\right)=f\frac 1{\omega^2r}\frac{\mathrm dr}{\mathrm dt}</math><br/>
Definiujemy stałą sedymentacji ''S''  jako <br/>
<math>S=\frac 1{\omega^2r}\frac{\mathrm dr}{\mathrm dt}</math><br/>
Stała sedymentacji wielkością charakteryzującą ruch cząsteczki w rozpuszczalniku równą prędkości sedymentacji na jednostkę przyspieszenia odśrodkowego. Jednostką stałej sedymentacji jest <math>\unit{1}{S\ (swedberg)} = \unit{10^{-13}}s</math>. <br/>

Dalej otrzymujemy:<br/>
<math>V\rho\left(1-\frac{\rho_s}\rho\right)=fS</math><br/>
<math>M/\rho\left(1-\frac{\rho_s}\rho\right)=fS N_A</math><br/>
gdzie:  ''M'' &mdash; masa cząsteczkowa makrocząsteczki, <math>N_A</math> &mdash; liczba Avogadro, a masa pojedynczej cząsteczki jest równa <math>m = V\rho = \nicefrac M{N_A}</math>.<br/>

Szybkość ruchu cząsteczki opisuje zależność:<br/>
<math>\frac{\mathrm dr}{\mathrm dt}=\frac{V(\rho-\rho_s)a}f</math><br/>
</ol>
===Wyznaczanie  masy cząsteczkowej===
Korzystając z zależności:
:<math>M\left(1-\frac{\rho_s}\rho\right)=fSN_A</math>
oraz ze wzoru Einsteina na współczynnik dyfuzji:
:<math>D=\frac{RT}{fN_A}</math>
gdzie: ''R'' &mdash; stała gazowa, ''T'' &mdash; temperatura [K], otrzymujemy:
:<math>M=\frac{RTS}{D\left( 1-\frac{\rho_s}\rho\right)}</math>.
====Uwaga:====
Często, definiując cząstkową objętość właściwą cząsteczki jako: <math>V_2=\frac1\rho</math>, w powyższych równaniach zastępujemy <math>\nicefrac{\rho_s}\rho</math> przez <math>V_2\cdot\rho_s</math>. <math>V_2</math> odpowiada zwiększeniu objętości w wyniku dodania 1 grama makromolekuł do wody (białka <math>\unit{0,7- 0,75}{\frac{ cm^3}g}</math>, zdenaturowane DNA <math>{0,55}{\frac{ cm^3}g}</math>).

====Równanie Svedberga====
:<math>M=\frac{RTS}{D(1-V_s\rho_s)}</math>,
''M'' zależy od:
*właściwości fizycznych cząsteczki: ''S'', <math>V_2</math>,
*warunków eksperymentalnych: ''D'', ''T'', &rho;,
*stałej fizycznej: ''R''.
Stąd można bezpośredniego wyznaczyć masę ''M'' w przeciwieństwie do innych metod doświadczalnych takich jak elektroforeza i  chromatografia, które bazują na porównaniu masy cząsteczki z wzorcem (cząsteczkami o znanych masach).

====Jak wyznaczamy stałą sedymentacji i masę cząsteczkową substancji rozpuszczonej?====
<ol><li>Korzystając z definicji stałej sedymentacji, po rozdzieleniu zmiennych i obustronnym scałkowaniu otrzymujemyzależność: <br/>
:<math>\ln r =S\omega^2 t+\mathrm{const}</math><br/>
gdzie ''r'' &mdash; położenie środka granicy pomiędzy roztworem klarownym i zawiesiną, <math>\ln r</math> zależy liniowo od czasu ze współczynnikiem nachylenia równym <math>S\omega^2</math>.
<li>Korzystając z równania Lamma<br/>
Strumień przez powierzchnię wycinka cylindra zawartego we wnętrzu naczynka wirówki opisuje równanie:<br/>
:<math>J=S\omega^2 rc -D\frac{\mathrm dc}{\mathrm dr}</math><br/>
Równanie Lamma, wyprowadzone w 1929 roku, opisuje rozkłady stężenia uzyskiwane w czasie wirowania:
:<math>\left(\frac{\mathrm dc}{\mathrm dt}\right) = -\frac 1r\frac{\mathrm d}{\mathrm dr}\left[\omega^2r^2Sc -Dr \frac{\mathrm dc}{\mathrm dr}\right] </math><br/>
Rozwiązywanie równania Lamma &mdash; metoda pochodnej czasowej (program [http://www.jphilo.mailway.com/dcdt+.htm DCDT+] dostępny w sieci) pozwala na wyznaczenie pochodnych czasowych rozkładów stężenia na podstawie radialnych dystrybucji otrzymanych w eksperymencie.<br/>
Następnie, po przeskalowaniu równania i uniezależnienia od czasu otrzymujemy rozkład <math>g(s)</math> mówiący o populacji cząsteczek o danym współczynniku sedymentacji.
<li>Metoda równowagi sedymentacyjnej<br/>
Stan równowagi sedymentacyjnej występuje przy niewielkiej liczbie obrotów (zwykle poniżej 20 000 obr/min). W stanie równowagi sedymentacyjnej substancja rozpuszczona wypełnia całą kuwetę, a jej stężenie wzrasta od menisku do dna kuwety.
Z warunków równowagi termodynamicznej można wyprowadzić wzór na masę cząsteczkową substancji rozpuszczonej:<br/>
:<math>M=\frac{2RT\ln\frac{c_2}{c_1}}{N_A(1-V_s\rho_s)\omega^2(r^2_2-r_1^2)}</math><br/>
gdzie: <math>c_1</math> i <math>c_2</math> stężenia makrocząsteczki w odległości <math>r_1</math> i <math>r_2</math> od osi obrotu w stanie równowagi sedymentacyjnej, uzyskiwanej zwykle po kilkudziesięciu godzinach wirowania.
<li>Metoda Archibalda<br/>
Niezależnie od stanu osiągnięcia równowagi sedymentacyjnej powierzchnia menisku (a) i dno kuwety (b) to dwa przekroje, przez które nie przemieszczają się sedymentujące cząsteczki. Czyli: <br/>
:<math>\frac 1{r_ac_a}\left(\frac{\mathrm dc}{\mathrm dr}\right)_a=\frac 1{r_bc_b}\left(\frac{\mathrm dc}{\mathrm dr}\right)_b=\frac{S\omega^2}D</math><br/>
stąd masa cząsteczkowa biopolimeru odpowiednio przy menisku i przy dnie kuwety:  <br/>
:<math>M_a=\frac{RT\left(\frac{\mathrm dc}{\mathrm dr}\right)_a}{(1-V_s\rho_s)\omega^2r_a^2c_a}\ M_b=\frac{RT\left(\frac{\mathrm dc}{\mathrm dr}\right)_b}{(1-V_s\rho_s)\omega^2r_b^2c_b}</math><br/>
dla mieszaniny polimerów <math>M_a \neq  M_b\;</math>.</ol>

==Wirówki i ultrawirówki==

Wirówki można podzielić ze względu na
*uzyskiwaną liczbę obrotów: 
**niskoobrotowe &mdash; do 5 000 obr/min, 
**średnioobrotowe &mdash; do 20 000 obr/min, 
**ultrawirówki &mdash; powyżej 20 000 obr/min. 
*Przeznaczenie: 
**analityczne,
**preparatywne, 
**specjalnego przeznaczenia. 

Wirówki i ultrawirówki wyposażone są w układy termostatujące umożliwiające kontrolę temperatury z dokładnością do 0,1 stopnia. W ultrawirówkach i wirówkach średnioobrotowych rotor jest umieszczony w komorze próżniowej, aby wyeliminować jego nagrzewanie się. Jeżeli wirowanie odbywa się w próżni próbki muszą być hermetycznie zamknięte. Wirowanie w ultrawirówkach może odbywać się z prędkością 60000 rpm, co odpowiada przyspieszeniu równemu 290 000 g.

Typy rotorów:
*rotor horyzontalny, 
*rotor analityczny,
*rotor kątowy.
Mieszaninę poddawaną wirowaniu umieszcza się w odpowiednich pojemnikach. W przypadku wirówek są to kubki wirownicze, a w przypadku ultrawirówek specjalne kuwety analityczne, wytrzymujące wysokie przeciążenia, skręcane przed pomiarami.

Kuweta analityczna składa się z metalowego korpusu oraz rdzenia z tworzywa ze zbiorniczkiem sektorowym zamkniętym z dwóch stron przez okienka kwarcowe. W połowie wysokości kuwety znajduje się otwór do jej napełniania. Istnieje kilka podstawowych typów kuwet analitycznych, np.: kuweta jedno- dwu- lub sześciosektorowa. Przykładowo kuweta dwusektorowa złożona jest z dwóch zbiorniczków, z których jeden jest napełniany badanym roztworem, a drugi rozpuszczalnikiem. Taka kuweta pozwala rejestrować sedymentację badanego roztworu na tle rozpuszczalnika.

==Systemy detekcji==

#System interferencyjny.
#System detekcji absorpcyjnej.
===System detekcji oparty na interferencji Rayleigha ===
<ol type="a"><li>Monochromatyczne światło przechodząc przez dwie równoległe szczeliny dwusektorowej kuwety zawierającej odpowiednio próbkę i bufor odniesienia  ulega interferencji dając w wyniku ciemne i jasne prążki.
<li>Jeśli gęstość próbki jest większa niż buforu odniesienia fala przechodząca przez próbkę jest opóźniona względem fali przechodzącej przez bufor odniesienia.
<li>Prążki przesuwają się prostopadle proporcjonalnie do różnicy stężeń pomiędzy próbką a buforem odniesienia.
</ol>
System detekcji oparty o interferencję Rayleigha umożliwia:
<ol type="a"><li>Pomiar stężenia próbki na podstawie zmian współczynnika odbicia. 
<li>Nieselektywny, pomiar całości materiału we wiązce.
<li>Analizę makrocząsteczek nie zawierających chromoforów (np. polisacharydy, węglowodory).
<li>Analizę próbek, które zawierają silnie absorbujące składniki buforu (np. ATP / GTP, DTT<sub>utleniony</sub>). 
<li>Jest to dobry system optyczny w przypadku bardzo stężonych próbek t.j. 100 mg/ml i dużych kompleksów.
</ol>
===System detekcji absorpcyjnej ===
<ol type="a"><li>Wykorzystuje zjawisko absorpcji promieniowania o określonej długości fali przez cząsteczki posiadające właściwości absorpcyjne.
<li>Lampa ksenonowa o zakresie 190 – 800 nm błyska z częstotliwością zgodna z prędkością obrotu rotora.
<li>Zmienna intensywność świecenia lampy jest normalizowana poprzez próbkowanie niewielkiej części światła padającego na detektor.
<li>Istnieje możliwość przeskanowania pełnego widma absorpcyjnego próbki dla ustalonego położenia radialnego.</ol>

System detekcji absorpcyjnej
<ol type="a"><li>Jest dobrym wyborem dla cząsteczek zawierających chromofory np. dla białek, DNA, etykietowanych i innych.
<li>Czułość od ok. 1 µg/ml.
<li>System selektywny - wybór długości fali obserwacji.
<li>Dla próbek złożonych możliwość monitorowania kilku składników dzięki obserwacjom absorpcji dla różnych długości fali w tym samym eksperymencie.</ol>
 
Obydwa systemy detekcji umożliwiają wyznaczenie <math>c(r)\;</math>, czyli stężenia w funkcji promienia.

==Eksperymenty ultrawirowania analitycznego==

===Wymagania===
*Próbka w roztworze.
*Masa molekularna od setek do kilku milionów daltonów.
*Około 20 µl-300 µl objętości próbki.
*Stężenie próbki w zakresie od 1µg/ml do 50 mg/ml.
===Typy eksperymentów===
(prędkości sedymentacji i równowagi sedymentacyjnej)
====Eksperyment prędkości sedymentacji==== 
Umożliwia wyznaczenie:
*Heterogeniczności próbki.
*Kształtu i wielkości cząsteczek lub kompleksów molekularnych oraz ich zmian.
*Współczynnika sedymentacji.
*Współczynnika dyfuzji.
*Współczynnika  tarcia.
*Masy cząsteczkowej.
*Stabilności próbki.

Eksperyment prędkości sedymentacji  prowadzi się przy dużych szybkościach rotacji, co prowadzi do przemieszczania się (sedymentacji) cząsteczek substancji rozpuszczonej w dół komórki pomiarowej i wytworzenia gradientu stężenia w kierunku radialnym, zwanego granicą (boundary).

Ponieważ istnienie granicy jest związane z gradientem stężenia to również i granica sedymentuje z upływem czasu.
Z uwagi na wzrastające stężenie substancji poniżej granicy, “siły” dyfuzji działają coraz efektywniej prowadząc do rozmywania się granicy (kolejne rejestrowane profile są bardziej pochyłe).
====Eksperyment równowagi sedymentacyjnej====
Pozwala na wyznaczenie:
*Masy molekularnej, masy składników słabo oddziałujących kompleksów, masy podjednostek.
*Stechiometrii w roztworze.
*Stałej asocjacji.
*Heterogeniczności próbki.

W eksperymencie równowagi sedymentacyjnej szybkość wirowania jest tak mała, że procesy dyfuzji skutecznie przeciwstawiają się procesom sedymentacji i ustala się równowagowy rozkład stężenia molekuł w komórce pomiarowej.
===Zalety pomiarów techniką ultrawirowania analitycznego===
*Zastosowanie do wszystkich nano i mikrocząsteczek.
*Brak oddziaływań z matrycami &mdash; brak artefaktów.
*Technika nie wymaga standardów.
*Heterogeniczne układy są dobrze rozseparowywane.
===Analiza danych uzyskanych podczas wirowania===
Program [http:/www.analyticalultracentrifugation.com/download.htm SEDFIT]
Kroki:
#Wprowadzić dane.
#Ustawić położenie menisku i dna kuwety.
#Wybrać model właściwy dla analizy danych.
#Wybrać parametry wstępne (najlepiej na podstawie informacji,  które dotyczą białka, a są uzyskane innymi metodami, np. dla  białka globularnego współczynnik tarcia = 1.2).
#Wykonać obliczenia.
#Przyjrzeć się krytycznie wynikom analizy i na tej podstawie dokonać modyfikacji (np. usunąć ostatnie krzywe).
#Uwzględnić poprawki związane z szumem, udokładnić objętość cząstkową, gęstość i lepkość buforu.
#Można powtórzyć p. 6  i 7.
#Zanotować wyniki.
===Czym się kierować analizując dane?===
#Zgromadzić dostępną wiedzę na temat obiektu.
#Wykonać kilka niezależnych eksperymentów (np. dla tych samych stężeń biomolekuł,lub dla różnych znanych stężeń biomolekuł).
#Wykonać eksperymenty różnymi metodami.
#Analizować jakość fitu.
#Dyskutować wyniki z osobami doświadczonymi (jeśli są takie).
#Kierować się zdrowym rozsądkiem.

Metody ultrawirowania analitycznego znajdują zastosowanie w przemyśle, np. podczas badania jakości i agregacji białek o znaczeniu terapeutycznym.

Różnica pomiędzy białkami a lekami niskocząsteczkowymi jest związana z tym, że aktywność białek stosowanych jako leki silnie zależy od ich konformacji cząsteczkowej.

Analizy za pomocą spektrometrii mas, czy krystalografii nie mówią czy białko jest w odpowiedniej, natywnej konformacji w roztworze, czy dimeryzuje (dimeryzacja może być pożądana lub przeszkadzać).

Ultrawirowanie umożliwia określenie czy białko jest aktywne biologicznie, czy w próbce są obecne agregaty i czy stabilna konformacja makromolekuł jest utrzymywana w zmiennych warunkach pH, temperatury i składu buforu.