Annach: Utworzono nową stronę "==Podział reakcji chemicznych ze względu na szybkości przebiegu== {| |Ultra-szybkie |→ |piko- nano- ,mikrosekundy |- |Szybkie |→ |sekundy |- |Średnio-szybk..."

2015-05-21T17:23:14Z

Utworzono nową stronę "==Podział reakcji chemicznych ze względu na szybkości przebiegu== {| |Ultra-szybkie |→ |piko- nano- ,mikrosekundy |- |Szybkie |→ |sekundy |- |Średnio-szybk..."

Nowa strona

==Podział reakcji chemicznych ze względu na szybkości przebiegu==
{|
|Ultra-szybkie
|→
|piko- nano- ,mikrosekundy
|-
|Szybkie
|→
|sekundy
|-
|Średnio-szybkie
|→
|minuty – godziny
|-
|Wolne
|→
|tygodnie
|-
|Bardzo wolne
|→
|tygodnie – lata
|}

Szybkość zależy od:
*stężenia reaktantów, katalizatorów i inhibitorów,
*temperatury,
*ciśnienia,
*przenikalności dielektrycznej.

==Historia==

* W 1850 roku L. Wilhelmy, wykonał hydrolizę sacharozy do glukozy i fruktozy, inicjowaną dodaniem kwasu. Reakcję monitorował mierząc skręcalność optyczną roztworu.
*W 1901 roku doktorant Waltera Nernsta zmierzył prędkość dźwięku m.in. w NO2 i zaobserwował zmiany koloru z brązowego (monomer) na bezbarwny (dimer) spowodowane zmianami ciśnienia w polu fali akustycznej.
*W 1920 roku A. Einstein zasugerował, że szybkość reakcji N2O4↔2NO2 można określić poprzez pomiar dyspersji dźwięku.
*W 1923 roku H. Hartridge i F.J.W. Roughton skonstruowali urządzenie przepływowe do mieszania dwóch roztworów, mieszanina przepływa przez długą rurę obserwacyjną, wzdłuż której umieszczone są detektory mierzące postęp reakcji.
*W 1940 roku B. Chance zbudował podobny przyrząd z zatrzymaniem przepływu i jednym detektorem.
*W 1947 roku R.G.W. Norrish i G. Porter skonstruowali spektrometr fotolizy błyskowej, w którym poprzez krótki i silny impuls światła inicjowane są reakcje chemiczne.
*W 1953 roku M. Eigen opisał zastosowanie metod absorbcji ultradźwięków, skoku pola elektrycznego i skoku temperatury do badania reakcji jonowych w roztworach wodnych, o czasach połówkowych aż do 1 ns; za co w 1967 roku otrzymał wraz R.G.W. Norrishem i G. Porterem Nagrodę Nobla.

==Co możemy mierzyć ultra-szybkimi metodami ?==
===Przemiany jednocząsteczkowe===
:<math>A\underset{k_{-1}}\overset{k_{+1}}\Longleftrightarrow B\;</math>

===Procesy asocjacji jedno- i wieloetapowe===
:<math>B+L\underset{k_{-1}}\overset{k_{+1}}\Longleftrightarrow K\;</math>

:<math>B+L\underset{k_{-1}}\overset{k_{+1}}\Longleftrightarrow B^* +L\underset{k_{-2}}\overset{k_{+2}}\Longleftrightarrow K\;</math>

:<math>B+L\underset{k_{-1}}\overset{k_{+1}}\Longleftrightarrow K_1\underset{k_{-2}}\overset{k_{+2}}\Longleftrightarrow K_2\;</math>

===Skomplikowane przemiany kinetyczne, np. dla białek oligomerycznych===
Celem badań jest powiązanie obserwowanego sygnału z odpowiednim mechanizmem asocjacji, wykazanie że wybrany mechanizm w pełni tłumaczy obserwacje doświadczalne i wyznaczeniu parametrów kinetycznych.
===Jednoetapowe procesy asocjacji ===
:<math>B+L\underset{k_{-1}}\overset{k_{+1}}\Longleftrightarrow K\;</math>
Gdy stężenie ligandu jest znacznie większe od stężenia białka, mamy do czynienia z reakcją pseudopierwszego rzędu, mierzony sygnał można przedstawić w postaci zależności monoeksponencjalnej
:<math>I(t) = A_1e^{-k_\mathrm{obs}t}+A_0\;</math>
a obserwowana stała szybkości wiąże się ze stałymi szybkości reakcji elementarnych wzorem:
:<math>k_\mathrm{obs} = k_{+1}[L]_0 +k_{-1}\;</math>.

===Dwuetapowe procesy asocjacji — wiązanie i izomeryzacja===
Gdy <math>[L]_0 \gg [B]_0\;</math> obserwowany sygnał jest dwueksponencjalną funkcją czasu:
:<math>B+L\underset{k_{-1}}\overset{k_{+1}}\Longleftrightarrow K_1\underset{k_{-2}}\overset{k_{+2}}\Longleftrightarrow K_2\;</math>

:<math>I(t) = A_0+A_1e^{-k_{\mathrm{obs},1}t}+A_2e^{-k_{\mathrm{obs},2}t}\;</math>
:<math>k_{\mathrm{obs},1} = k_{+1}[L]_0 +k_{-1}\;</math>

:<math>k_{\mathrm{obs},2} = k_{-2}+\frac{k_{+2}}{1+\frac{K_1}L}\;</math>
:<math>K_1 = \frac{k_{-1}}{k_{+1}}\;</math>
W warunkach równowagowych dla <math>[K]_1\ \text{i}\ [K]_2=0\ \text{dla}\ t=0</math>, obserwowany sygnał jest monoeksponencjalny, z
:<math>k_\mathrm{obs} = \frac{k_{+1}[L]_0(k_{+2}+k_{-2})+k_{-1}k_{-2}}{k_{1}[L]_0+k_{-1}k_{+2}}\;</math>
Gdy <math>k_{-1}\gg k_{+2}\;</math>.
:<math>k_\mathrm{obs} =k_{+2}+\frac{k_{-2}}{1+\frac{K_1}{[L]}}\;</math>

==Przepływowe metody relaksacyjne ==
===Metody przepływowe (……..-flow) ===
Ważne!
*Kontrola temperatury.
*Czas mieszania reagentów (1-5 ms) musi być zaniedbywalny w porównaniu z czasem reakcji.
*Analiza danych musi być możliwa do wykonania dla skal czasowych odpowiadających przebiegowi reakcji (odpowiedni zestaw danych).
===Pomiary relaksacyjne — etapy:===
*Wybór techniki pomiaru.
*Urzygotowanie próbki.
**Odgazowanie,
**Wybór metody śledzenia reakcji,
**Ew. wybór fali wzbudzenia.
**Wybór sposobu obserwacji:
***Wybrana długość fali.
***Filtry interferencyjne.
***Filtry cut-off.
*Pomiary wstępne.
**Ustalenie wartości czasu martwego.
**Ślepe próby.
**Dobór czasu obserwacji.
**Dobór ilości strzałów potrzebnych do zastąpienia roztworów.
**Dobór uśrednianej liczby prób.
*Uważne monitorowanie reakcji (odrzucenie artefaktów).
*Analiza danych.
*Wnioski.
===Techniki eksperymentów===
<ol><li>Zatrzymany przepływ 
Dwa roztwory są wstrzykiwane do komory mieszania, a następnie przepływają przez kuwetę. Za kuwetą znajduje się strzykawka stopująca przepływ w określonym czasie. Obserwuje się zmiany stężeń reagentów w funkcji czasu, w określonej pozycji.
Potrzebne są szybkie metody detekcji (zazwyczaj spektrofotometryczne).
 '''Zaleta''': małe zużycie reagentów.
<li>Ciągły przepływ 
Po wstrzyknięciu do komory mieszania i wymieszaniu reagenty przepływają w sposób ciągły ze stałą prędkością v, a stężenie produktów zwiększa się wraz z odległością od komory mieszania (stężenie i odległość zwiększa się z czasem).
 '''Wada''': zużycie dużych ilości reagentów.
<li>Przyspieszony przepływ 
Odmiana techniki ciągłego przepływu. Tłoki strzykawek poruszają się z przyspieszeniem, powodując zwiększenie szybkości przepływu reagentów w kuwecie pomiarowej. Stężenie produktów w określonym punkcie odpowiada coraz krótszemu czasowi, jaki upłynął od czasu rozpoczęcia reakcji.
 '''Wada''': potrzebna bardzo szybka metoda detekcji
<li>Wygaszony przepływ 
Możliwość izolacji intermediatów i produktów reakcji na pewnym jej etapie i identyfikacji odpowiednią metodą analityczną. Technika komplementarna do zatrzymanego przepływu, gdy w trakcie reakcji nie zachodzą zmiany spektralne. Po wymieszaniu reagentów przepływają one przez odpowiednio dobraną pętlę opóźnienia, a następnie są mieszane z odczynnikiem blokującym reakcje. Zbierane próbki są przekazywane do analizy. Czas zatrzymania reakcji zależy od prędkości przepływu reagentów i długości pętli opóźniającej.
 '''Zaleta''': małe zużycie reagentów, możliwość zastosowania do substancji nieczynnych optycznie.
</ol>
===Najczęściej spotykane spektroskopowe metody monitorowania reakcji biochemicznych w poznanych technikach===
#Zmiany absorpcji, np. w trakcie tworzenia się absorbujących układów.
#Zmiany fluorescencji — związane ze zmianą środowiska tryptofanu.
#Dichroizm kołowy— zmiana struktury układu.

====Przykład (Biophys Chem. 2007, 125:260-8)====
Opis procesu wiązania analogu obydwu substratów — inhibitora PME-6-thio-gua przez enzym PNP.

Wyjściowo — PNP składa się z identycznych podjednostek.

Rozpatrywane mechanizmy:
<ol type="I"><li>Ligand jest wiązany przez każde z aktywnych miejsc w procesie jednoetapowym. <math>C_I\;</math> — kompleks białko — <math>I\;</math> cząsteczek liganda, po związaniu miejsca aktywne nie ulegają reorganizacji konformacyjnej.
:<math>P+L\underset{k_{-1}}\overset{k_{+1}}\Longleftrightarrow C_1 \;</math>

:<math>C_1+L\underset{k_{-2}}\overset{k_{+2}}\Longleftrightarrow C_2 \;</math>

:<math>C_2+L\underset{k_{-3}}\overset{k_{+3}}\Longleftrightarrow C_2 \;</math>
<li>Ligand jest wiązany przez każde z aktywnych miejsc w procesie dwuetapowym (Schemat <xr id="fig:schemat_1"/>).</ol>
[[Plik:mechanizm wiązania ligandu w procesie dwuetapowym.png|thumb|center|400px|<figure id="fig:schemat_1"/>Mechanizm wiązania ligandu w procesie dwuetapowym. <math>C_I\;</math> — kompleks białko — <math>I\;</math> cząsteczek liganda, po związaniu miejsca aktywne nie ulegają reorganizacji konformacyjnej. <math>K_I\;</math> — kompleks białko — <math>I\;</math> cząsteczek liganda, po związaniu miejsca aktywne uległ reorganizacji konformacyjnej. <math>C_IK_J\;</math> — kompleks białko z <math>I+J\;</math> ligandami, gdzie <math>I\;</math> miejsc nie uległo, a <math>J\;</math> — uległo reorganizacji konformacyjnej.]]
Najpierw wykonano pomiary stacjonarne na podstawie których wybrano odpowiednie fale dla wzbudzenia i obserwacji emisji.

Wykonano pomiary kontrolne (bufor-bufor, ligand-bufor, białko-bufor; ostatni w celu ustalenia początkowego poziomu fluorescencji i oszacowania czasu martwego). Następnie wykonano pomiary stopped-flow przy mieszaniu ligandu z buforem. Badano przebieg reakcji w różnym pH 6.5-8.2, przy różnym stężeniu białka i i inhibitora. Mierzonym sygnałem była fluorescencja. Zakładaliśmy, że do całkowita fluorescencja jest sumą wkładów od wolnego ligandu, białka i wszystkich możliwych kompleksów ligand-białko.
:<math>F(t) =\sum_{x} F_x\cdot c_x(t)\;</math>.
Otrzymane przebiegi były jednocześnie analizowane numerycznie przy założeniu różnych modeli reakcji.

'''Wniosek''': obserwowany proces jest dobrze opisany modelem jednoetapowym.
Stałe asocjacji malały wraz ze wzrostem pH (enzym „nie lubi” formy anionowej inhibitora), stałe dysocjacji były niezależne od pH.

==Metody perturbacyjne ==
Ominięcie problemu związanego z maksymalnie szybkim mieszaniem reagentów dla ultraszybkich reakcji.

W czasie <math>t=0\;</math> mieszanina reakcyjna jest w równowadze chemicznej. Następnie gwałtownie zaburza się warunki stacjonarne i obserwuje sposób dochodzenia mieszaniny do nowej równowagi w zmienionych warunkach.
*Błyskowa fotoliza laserowa (laser flash photolysis).
*Skok temperatury (T-jump): wymagana zmiana <math>\Delta H\;</math>.
*Skok ciśnienia (pressure jump): wymagana zmiana <math>\Delta V\;</math>.
*Impuls pola elektrycznego (electric field impulse): w reakcji musi wystąpić jonizacja.
*Skok pH (pH-jump): stan molekuły musi się zmieniać w niewielkim zakresie pH.

===Błyskowa fotoliza laserowa===
Kondensator jest rozładowany przez lampę błyskową wypełniona kryptonem, argonem lub ksenonem, co powoduje intensywny błysk światła. Ogniskowanie na próbce powoduje lokalne niestabilne wzbudzenie molekuł.
Molekuły mogą się rozpaść i reagować dalej, mogą uwolnić zaabsorbowaną energię różnymi drogami i wrócić do stanu podstawowego.

===Skok temperaturowy===
Jest osiągany poprzez :
*rozładowanie kondensatora poprzez roztwór w kuwecie,
*intensywny impuls laserowy,
*zmiany temperatury są rzędu 5 — 10°C.
===Skok pH===
Wykorzystuje się związki, które pod wpływem intensywnego impulsu laserowego uwalniają protony, np. 2-NBA (2-Nitrobenzaldehyde). Mieszaninę próbka — NBA umieszcza się w kuwecie i oświetla błyskiem światła. Możliwe zmiany pH są rzędu 2.

Zwykle relaksacyjne powroty do równowagi można opisać równaniem eksponencjalnym.
:<math>\Delta A(t) = \Delta A(0) e^{-\frac t\tau}\;\;</math>,
τ — czas relaksacji.

Przykładowo dla reakcji:
:<math>A+B\overset{k_1}\underset{k_{-1}}\Longleftrightarrow P\;</math>.
Mamy <math>\frac{\mathrm d[P]}{\mathrm dt} = k_1 [A][B]-k_{-1}[P]\;</math> i <math>\frac{k_1}{k_{-1}} = \frac{[P]_\mathrm{eq}}{[A]_\mathrm{eq}[B]_\mathrm{eq}}\;</math>. W równowadze:
:<math>[P] = [P]_\mathrm{eq} +\Delta [P]\;</math>,
:<math>[A] = [A]_\mathrm{eq}+\Delta [A] = [A]_\mathrm{eq}-\Delta [P]\;</math>,
:<math>[B] = [B]_\mathrm{eq}+\Delta [V] = [B]_\mathrm{eq}-\Delta [P]\;</math>,
:<math>\Delta [P] = -\Delta [A]_\mathrm{eq} = \Delta [B]_\mathrm{eq}\;</math>.
Warunki graniczne:
:<math>\Delta [P]_{(t=0)} = \Delta [P]_0\;</math>,
:<math>\Delta [P]_{(t=\infty)} = 0\;</math>.
Podstawiając:
:<math>\frac{\mathrm d[P]}{\mathrm dt} = \frac{\mathrm d([P]_\mathrm{eq}+\Delta ]P])}{\mathrm dt}=\frac{\mathrm d(\Delta [P])}{\mathrm dt} = k_1[A][B]-k_{-1}[P]\;</math>,
:<math>\frac{\mathrm d[P]}{\mathrm dt}=k_1([A]_\mathrm{eq}-\Delta [P])([B]_\mathrm{eq}-\Delta [P]) -k_{-1}([P]_\mathrm{eq}+\Delta[P])\;</math>,
:<math>\frac{\mathrm d[P]}{\mathrm dt}=k_1[A]_\mathrm{eq}[B]_\mathrm{eq}-k_{-1}[P]_\mathrm{eq}-k_1(([A]_\mathrm{eq}\Delta[P]+[B]_\mathrm{eq}\Delta[P])-(\Delta [P])^2) - k_{-1}\Delta [P] = -(k_1([A]_\mathrm{eq}+[B]_\mathrm{eq})+k_{-1})\Delta [P]\;</math>,
dla małych odchyleń od równowagi
:<math>-\frac{\mathrm [P]}{\mathrm dt} = \frac{\Delta [P]}\tau\;</math>.
Otrzymujemy:
:<math>\tau = \frac 1{k_{-1}+k_1([A]_\mathrm{eq}+[B]_\mathrm{eq})}\;</math>.

Metody Biofizyki Molekularnej/Metody relaksacyjne - Historia wersji

Annach: Utworzono nową stronę "==Podział reakcji chemicznych ze względu na szybkości przebiegu== {| |Ultra-szybkie |→ |piko- nano- ,mikrosekundy |- |Szybkie |→ |sekundy |- |Średnio-szybk..."