Annach: Utworzono nową stronę " Celem wykładu „Metody Biofizyki Molekularnej” przeznaczonego dla studentów kierunku „Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie” jest poznanie podstaw metod..."

2015-05-21T17:11:22Z

Utworzono nową stronę " Celem wykładu „Metody Biofizyki Molekularnej” przeznaczonego dla studentów kierunku „Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie” jest poznanie podstaw metod..."

Nowa strona

Celem wykładu „Metody Biofizyki Molekularnej” przeznaczonego dla studentów kierunku „Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie” jest poznanie podstaw metod niespektroskopowych stosowanych przez współczesną fizykę eksperymentalną do badania struktury biocząsteczek oraz procesów zachodzących na poziomie molekularnym.

Po wysłuchaniu wykładu studenci powinni umieć odpowiedzieć na następujące pytania:
*Z punktu widzenia metody:
**Jakie warunki musi spełniać obiekt, aby można było badać go wiarygodnie wybraną metodą?
**Jakie są ograniczenia metody?
*Z punktu widzenia obiektu:
**Czy dana metoda nadaje się do badania wybranego obiektu i czego możemy się o nim dowiedzieć stosując wybrana metodę?

W trakcie wykładu poruszane będą następujące zagadnienia:
*Oczyszczanie i separacja makrocząsteczek:
**[[Metody_Biofizyki_Molekularnej/Chromatografia‎‎ |chromatografia]],
**[[Metody_Biofizyki_Molekularnej/Elektroforeza‎‎|elektroforeza]].
*Metody hydrodynamiczne:
**[[Metody_Biofizyki_Molekularnej/Ultrawirowanie_analityczne‎‎|ultrawirowanie]],
**[[Metody_Biofizyki_Molekularnej/Wiskozymetria‎‎|wiskozymetria]].
*Określanie struktur chemicznych i przestrzennych cząsteczek:
**[[Metody_Biofizyki_Molekularnej/Spektrometria_mas‎‎ |spektrometria mas]],
**[[Metody_Biofizyki_Molekularnej/Krystalografia_białek‎‎|krystalizacja i rentgenografia kryształów]].
*Metody termodynamiczne:
**[[Metody_Biofizyki_Molekularnej/Kalorymetria‎‎|kalorymetria]],
**[[Metody_Biofizyki_Molekularnej/Osmometria‎‎|osmometria]].
*[[Metody_Biofizyki_Molekularnej/Metody_relaksacyjne‎‎ |Metody relaksacyjne]]:
**zatrzymanego przepływu,
**perturbacyjne.
*Nanobiologia — obserwacje, spektroskopia i manipulacje pojedynczymi molekułami:
**[[Metody_Biofizyki_Molekularnej/Mikroskopia_optyczna_elektronowa‎‎|mikroskopia optyczna i elektronowa]],
**[[mikroskopia sil atomowych (AFM)]],
**[[Metody_Biofizyki_Molekularnej/Szczypce_optyczne‎‎|szczypce optyczne]] i [[magnetyczne]].

Obiektami pomiarów są makrocząsteczki biologiczne nazywane zamiennie makromolekułami, biocząsteczkami lub biopolimerami. Są to związki o masie do kilku milionów daltonów tworzone z podjednostek: białka — z aminokwasów, kwasy nukleinowe — z nukleotydów, polisacharydy — z monosacharydów.

Właściwości makromolekuł jakie wykorzystuje się podczas ich identyfikacji i charakterystyki to:
*powinowactwo do innych molekuł,
*ładunek elektryczny,
*kształt.
*masa,
*hydrofobowość,
*lepkość,
*zdolność krystalizowania.

Przy tworzeniu trójwymiarowych struktur makrocząsteczek takich jak białka i kwasy nukleinowe zasadniczą rolę odgrywają wiązania wodorowe. Są to słabe oddziaływanie elektrostatyczne pomiędzy elektroujemnym atomem (akceptorem), a atomem wodoru, który jest kowalencyjnie połączony z innym atomem elektroujemnym (donorem). W wiązaniu wodorowym wodór pełni rolę mostka łączącego dwa elektroujemne atomy (O,N,P).

Charakterystyczną cechą biocząsteczek jest wąski zakres warunków chemicznych (pH, siła jonowa) i fizycznych (temperatura, ciśnienie) w których pełnia prawidłowo funkcje biologiczne. W związku z tym aby nie uszkodzić w sposób nieplanowany biomolekuł należy uważnie zaplanować pomiary eksperymentalne biorąc pod uwagę wpływ środowiska pomiarowego na stabilność makromolekuł. Należy odpowiedzieć w jakich warunkach najkorzystniej będzie wykonywać pomiary, a więc co wybrać:
*Jaki bufor?
*W jakiej temperaturze pracować?
*Jaka siła jonowa?
*Jakie stężenie białka?
*Czy stosować dodatkowe odczynniki:
**środki redukujące (beta-merkaptoetanol, DTT),
**odczynniki utleniające,
**inhibitory proteaz,
**odczynniki denaturujące,
**detergenty jonowe i niejonowe,
**związki wiążące kwasy nukleinowe?

Planując pomiary, należy umieć oszacować stężenie makromolekuł.

Przypominamy, że:

'''Masa cząsteczkowa''' to masa określonej cząsteczki, wyrażona w atomowych jednostkach masy (Da, u) będąca sumą mas atomowych pierwiastków wchodzących w jej skład. Jednostka masy atomowej (u) jest równa 1/12 masy atomu węgla 12C <math>(\unit 1 {Da},\ u =\unit{1,66\cdot10^{−24}} g)</math>.
Masę cząsteczkową białek podaje się najczęściej w kilodaltonach, np. GFP <math>M=\unit{23}{ kDa}</math>.

'''Masa molowa''' to masa jednego mola substancji wyrażona w gramach (gram/mol).

1 mol — liczba cząsteczek równa liczbie atomów zawartych w masie 0.12 kg czystego nuklidu 12C. Wynosi ona <math>\unit{6,02\cdot10^{23}}{\frac1{mol}}</math> (liczba Avogadra NA)
(masa molowa <math>M_m</math> jest taką liczbą gramów danej substancji, która jest co do wielkości równa jej (względnej) masie cząsteczkowej <math>M_c</math>, wyrażonej w atomowych jednostkach masy)

:'''Masa molowa [g/mol] = średnia masa cząsteczkowa [Da]'''

Wyznaczanie stężenia białek na podstawie zawartości aminokwasów aromatycznych:
*tryptofanu,
*tyrozyny,
*fenyloalaniny.
Współczynnik ekstynkcji w 280 nm:
*Trp — <math>\unit{5500}{\frac 1{ Mcm}}</math>,
* Tyr — <math>\unit{1490}{\frac 1{ Mcm}}</math>,
* Phe — <math>\unit{125}{\frac 1{ Mcm}}</math>.

:<math>\varepsilon_\mathrm{bialka} = N_\mathrm{Tyr}\cdot \varepsilon_\mathrm{Tyr} + N_\mathrm{Trp}\cdot \varepsilon_\mathrm{Trp} + N_\mathrm{Phe}\cdot \varepsilon_\mathrm{Phe}</math>

prawo Lamberta-Beera
:<math>A(C_o)=\varepsilon Cl</math>
stężenie białka[mol/l]
:<math>\frac{A}{\{\unit{\varepsilon_\mathrm{bialka}}{\left[\frac 1{Mcm}\right]} \cdot \unit{l}{[cm]}\}}</math>

'''Stężenie procentowe białka''':
:ilość gramów białka w 100 ml roztworu
::np. 1% = 1 g/100 ml = 10 mg/ml.

'''Stężenie molowe''':
:ilość moli białka w litrze roztworu (ozn. [M] = [mol/l]).

'''Procentowy współczynnik ekstynkcji''' odpowiada absorpcji białka o stężeniu 1% w kuwecie o długości drogi optycznej 1cm. Jednostka <math>\frac 1{\frac {\mathrm g}{100\, \mathrm{ml}}\mathrm{cm}}</math>.

'''Molowy współczynnik ekstynkcji''' odpowiada absorpcji 1 M białka w kuwecie o długości drogi optycznej 1 cm. Jednostka <math>\unit{}{\left[\frac 1{M cm}\right]}</math>.

Zależność pomiędzy molowym a procentowym współczynnikiem ekstynkcji:
:<math>\varepsilon \cdot \unit{10}{\left[\frac 1{M cm }\right]} = \varepsilon[\%] \cdot</math> '''masa molowa białka'''.

Jeśli nie wiemy nic o białku to przyjmuje się, ze <math>\varepsilon_\mathrm{bialka}[\%]=10</math>
:(dla większości białek <math>\varepsilon[\%]= 4 - 24</math>).

Przeliczanie stężenia białka z M (czyli mol/l) na mg/ml i odwrotnie:
:'''X [mol/l]''' X [mol] * masa molowa [g/mol]/l = X [mol] * masa molowa *1000[mg/mol]/1000 ml = '''X * masa molowa [g] = Y [mg/ml]'''
:'''Y [mg/ml]''' '''Y / masa molowa [g] = X [M]'''.

Celem wielu pomiarów biofizycznych jest m.in. wyznaczenie średniej masy biocząsteczek. Najczęściej spotykamy się z wagowo (masowo) średnią masą cząsteczkowa lub ilościowo (liczbowo) średnią masą cząsteczkową. Definicje tych wielkości są dyskutowane w dalszej części wykładu (osmometria).

Metody Biofizyki Molekularnej/Wstęp - Historia wersji

Annach: Utworzono nową stronę " Celem wykładu „Metody Biofizyki Molekularnej” przeznaczonego dla studentów kierunku „Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie” jest poznanie podstaw metod..."