Annach: Utworzono nową stronę "Pracownia Biologii Molekularnej Część II Plan ćwiczeń wykonywanych w ramach Pracowni Biologii Molekularnej, część II — Ekspresja i oczysz..."

2015-05-21T17:03:58Z

Utworzono nową stronę "<center><b><big>Pracownia Biologii Molekularnej Część II Plan ćwiczeń wykonywanych w ramach Pracowni Biologii Molekularnej, część II — Ekspresja i oczysz..."

Nowa strona
<center><b><big>Pracownia Biologii Molekularnej

Część II

Plan ćwiczeń wykonywanych w ramach Pracowni Biologii Molekularnej, część II — Ekspresja i oczyszczanie białek.
</big></b></center>
==I spotkanie: Ekspresja białka w komórkach E. coli==
===Materiały i aparatura niezbędne do wykonania ćwiczenia I===
*Pożywka LB z agarem do hodowli stałej.
*Roztwór ampicyliny o stężeniu 100 mg/ml.
*Szalki Petriego.
*Cieplarka.
*Palnik, zapałki, 70% roztwór etanolu, eza.
*Pipety, sterylne tipsy o pojemności do 200 <math>\mu</math>l.
===Wykonanie ćwiczenia===
#Przygotować i podpisać szalki Petriego.
#Roztopić w mikrofalówce pożywkę LB z agarem o objętości 50 ml dla każdej pary osób wykonujących ćwiczenie, a następnie schłodzić do temperatury ok. 40 – 50°C, czyli takiej, przy której nie odczuwamy parzenia przy dotykaniu naczynia ręką.
#Gdy pożywki są ochłodzone dodać 50 μl ampicyliny o stężeniu wyjściowym 100 mg/ml uzyskując stężenie końcowe 100 μg/ml.
#Rozlać pożywkę stałą na szalki Petriego.
#Włączyć i ustawić cieplarkę na 37°C.
#Szalki wstawić do cieplarki w celu wysuszenia na około pół godziny.
#Po wysuszeniu wykonać posiew redukcyjny przenosząc, za pomocą ezy wysterylizowanej w płomieniu palnika, bakterie zawierające wektor z plazmidem białka na szalkę Petriego.
# Szalkę wstawić do cieplarki i przechować w niej do następnego dnia.
#Następnego dnia osoba wskazana przez asystenta przenosi szalki z cieplarki do lodówki.

==II spotkanie: Ekspresja białka w komórkach E. coli — ciąg dalszy==
===Materiały i aparatura niezbędne do wykonania ćwiczenia II===
*Kolby z 50 ml pożywki LB do hodowli płynnej.
*Roztwór ampicyliny o stężeniu 100 mg/ml.
*Roztwór IPTG o stężeniu 1M.
*Cieplarko-wytrząsarka.
*Palnik, zapałki.
*Pipety i sterylne tipsy .
===Wykonanie ćwiczenia===
#Podpisać kolbę o objętości 250 ml. Jedna z osób przygotowuje dwie kolby i czynności 1-6 wykonuje dla obydwu kolb.
#Przygotować w opisanej kolbie, w obecności włączonego palnika gazowego 50 ml LB
#Dodać do kolby 50 μl ampicyliny o stężeniu 100 mg/ml.
#Do kolby dodać za pomocą pipety z wysterylizowaną końcówką 1 ml hodowli nocnej.
#Wstawić do wytrząsarki i energicznie wytrząsać w temperaturze37°C.
#Pobierać co 30 minut 1,5 ml roztworu i sprawdzać OD. Dane umieścić w tabeli. Roztwór po pomiarze wylewać do przygotowanego pojemnika do sterylizacji.
#Po osiągnięciu OD600 w zakresie 0.5 – 0.7 zaindukować hodowlę dodając do kolby 50 μl IPTG o stężeniu wyjściowym 1M uzyskując stężenie końcowe 1 mM. Osoba, która przygotowała dwie kolby do jednej z nich NIE dodaje IPTG.
#Wstawić kolby do wytrząsarki.
#Po odpowiednim czasie (1, 2, 3, 4 godziny) pobierać po 1 ml z każdej kolby do sterylnej opisanej ependorfówki. Zapisać oznaczenia ependorfówek.
#Odwirować osad.
#Supernatant wylać do zbiornika, w którym zostanie wysterylizowany.
#Osad zawiesić w 50 μl buforu denaturującego i zamrozić w temperaturze -80°C.
#Po zakończeniu hodowli pobrać po 5 ml z kolby do sterylnej opisanej falkonówki i odwirować osad.
#Supernatant wylać do zbiornika, w którym zostanie wysterylizowany.
#Osad zamrozić w falkonówce w temperaturze -80°C.

==III spotkanie: Kontrola wydajności ekspresji białka w E. coli metodą elektroforezy denaturującej==
===Odczynniki niezbędne do wykonania ćwiczenia III===
*Odczynniki do przygotowania żeli:
**30% roztwór akrylamidów,
**woda dejonizowana,
**TEMED,
**10% APS,
**1.5 M bufor Tris-HCl, pH 8.8,
**0.5 M Tris-HCl, pH 6.8,
**10% SDS;
*barwnik denaturujący do białek (5x stężony),
*bufor glicynowy do elektroforezy SDS-PAGE 1x stężony,
*barwnik do barwienia żelu po elektroforezie (BioRad),
*etanol do mycia szybek elektroforetycznych,
*elektroforetyczny marker białkowy.

===Przygotowanie i przeprowadzenie elektroforezy===
====Przygotowanie żelu poliakrylamidowego.====
<ol><li>Starannie umyć szybki elektroforetyczne wodą, wytrzeć ręcznikiem papierowym i przetrzeć wewnętrzne powierzchnie etanolem.
<li>Każda z osób składa ze sobą dwie szybki (szybkę krótszą i dłuższą) w taki sposób, aby dolne krawędzie szyb były na jednym poziomie, a spacer’y znajdowały się w wewnętrznej przestrzeni pomiędzy płytkami.
<li>Złożone szybki spiąć za pomocą przeznaczonych do tego klamr i zamocować na podstawce do wylewania żeli.
<li>Sporządzić roztwór żelu separującego (dolnego) o odpowiednim stężeniu (według Tab. <xr id="fig:1"/>). <br/>
Ponieważ objętości roztworów (10 ml dla żelu separującego i 3 ml dla żelu ściągającego) wystarczają na przygotowanie dwóch żeli studenci przygotowują roztwory parami.
<figure id="fig:1">
{|class="wikitable"
!Typ żelu
!Woda dejonizo-wana
!30% akrylo-amid
!1.5 M Tris-HCl pH 8.8
!0.5 M Tris-HCl pH 6.8
!10% SDS
!10% APS
!TEMED
!Całkowi-ta objętość
|-
|Żel ściąga-jący 4%
|1.82 ml
|0.42 ml
| -------
|0.75 ml
|30 μl
|30 μl
|3 μl
|3 ml
|-
|Żel separu-jący 12 %
|3.4 ml
|4.0 ml
|2.5 ml
| --------
|100 μl
|70 μl
|7 μl
|10 ml
|}
<caption>Skład 12 % żelu separującego (dolnego) i 4% żelu ściągającego (górnego) . Objętość przygotowanego roztworu wynosi odpowiednio 10 i 3 ml i wystarcza na wylanie dwóch płytek.</caption>
</figure>
<ol type="a">
<li>Wymieszać ostrożnie wszystkie składniki oprócz TEMEDU i APS.
<li>Odgazowywać roztwór przez 10 minut (opcjonalnie).
<li>Dodać APS i TEMED.</ol>
<li>Szybko wlać mieszaninę pomiędzy płytki szklane do takiej wysokości, żeby zostawić miejsce na około 1 cm żelu górnego i grzebień.
<li>Po wylaniu żelu upewnić się, że nie ma w nim bąbli powietrza.
<li>W celu odcięcia dostępu tlenu przeszkadzającego polimeryzacji na żel nalać ostrożnie 1-2 mm wody. Pozostawić do polimeryzacji (45 minut).
<li>Po spolimeryzowaniu żelu separującego przygotować żel ściągający według Tab.1.
<ol type="a">
<li>Wymieszać ostrożnie wszystkie składniki oprócz TEMEDU i APS.
<li>Odgazowywać roztwór przez 10 minut (opcjonalnie).
<li>Dodać APS i TEMED</ol>
<li>Szybko zlać wodę znad żelu dolnego i osuszyć ręcznikiem papierowym.
<li>Natychmiast wlać mieszaninę pomiędzy płytki szklane do ich górnej granicy. Uważać aby nie powstały pęcherzyki powietrza.
<li>Ostroznie włożyć grzebień.
<li>Pozostawić do polimeryzacji (30 - 45 minut)
</ol>

===Przygotowanie układu do elektroforezy===
# Zdjąć złożone szybki z żelem z podstawki i wstawić do aparatu do elektroforezy
#Zalać żel buforem glicynowym (1 x stężonym). Napełnić buforem naczynie elektrodowe tak, aby górna i dolna część żelu były zanurzone w buforze.
#Wyjąć ostrożnie grzebień z żelu. Uważać aby nie oderwać fragmentów żelu.
#Za pomocą pipety automatycznej usunąć pęcherzyki powietrza z dolnej części żelu.

===Przygotowanie i nanoszenie próbek===
#Przygotować łaźnię wodną lub włączyć blok grzejny i nastawić temperaturę na 95°C.
#Rozmrozić ependorfówki z zamrożonymi po hodowli próbkami elektroforetycznymi:<ol type="a"><li>Próbka pobrana po 1 godzinie hodowli.<li>Próbka pobrana po 2 godzinach hodowli.<li>Próbka pobrana po 3 godzinach hodowli.<li>Próbka pobrana po 4 godzinach hodowli.</ol>
#Inkubować wszystkie próbki we wrzącej łaźni wodnej lub bloku grzejnym przez 5 min.
#Zwirować próbki, tak aby opadła na dno ciecz, która skropliła się w czasie inkubacji na zamknięciu ependorfówki
#Nanieść po 30 μl każdej z próbek do studzienek w żelu przy pomocy pipety automatycznej.
#Do jedenj ze studzienek nanieść marker białkowy otrzymany od asystenta.
#Zanotować położenie próbek na żelu.
#Zanotować masy białek wchodzących w skład markera.

===Wykonanie elektroforezy===
#Przeprowadzić elektroforezę wstępną przy napięciu 100-120 V. Po wniknięciu próbek w żel separujący zwiększyć napięcie do 150-160 V. Po wniknięciu próbek w żel separujący zwiększyć napięcie do 150 V Kontynuować rozdział dopóki barwnik nie znajdzie się 0.5 cm od końca żelu.
#Po skończonym rozdziale odłączyć napięcie, wylać bufor i wyjąć żel z aparatu.

===Barwienie żelu i dokumentacja===
#Ostrożnie oddzielić szyby, wyjąć żel i za pomocą szpatułki przenieść do pojemnika.
#Do pojemnika wlać ostrożnie wodę (200 ml na każdy żel).
#Płukać przez 5 minut.
#Przytrzymując żel ręką w rękawiczce wylać wodę z pojemnika.
#Czynności 2-4 powtórzyc dwukrotnie.
#Nalać do pojemnika z żelem barwnik (Bio-Safe Coomassie Stain, BioRad) w takiej ilości, aby zakrył żel.
#Zostawić żel w barwniku na ok. 1 h, delikatnie mieszając.
#Przytrzymując żel ręką w rękawiczce zlać barwnik spowrotem do pojemnika.
#Nalać do kuwety ostrożnie wodę i płukać przez 30 minut.
#Wylać wodę.
#Nalać świeżą porcję wody i płukać żel na kołysce.
#Nastepnego dnia po odbarwieniu żeli asystenci wykonują ich fotografie i wysyłają studentom.

==IV spotkanie: Oczyszczanie białka etykietowanego ogonem sześciohistydynowym na kolumienkach wirowniczych Ni-NTA==
===Materiały niezbędne do wykonania ćwiczenia III===
<ul><li>Kolumienki wirownicze Ni-NTA, falkonówki, ependorfówki.
<li>Bufory dołaczone do zestawu kolumienek wirowniczych:
<ol type="a"><li>Bufor do lizy.
<li>Bufor do mycia.
<li>Bufor do elucji.</ol>
<li>10% roztwór siarczanu streptomycyny.
<li>Lizozym o stężeniu 10 mg/ml.</ul>

===Wykonanie oczyszczania===
#Rozmrozić osad zebrany w falkonowce z hodowli bakteryjnej (5 ml).
#Osad zawiesić w 630 μl buforu do lizy.
#Dodać 70 μl rotworu lizozymu o stężeniu 10 mg/ml i wymieszać.
#Inkubować mieszaninę w lodzie 15 – 30 minut.
#Odwirować zhomogenizowany ekstrakt bakteryjny 15-30 minut przy przyspieszeniu 12000g w temperaturze 4°C.
#Przenieść supernatant do nowej, oznaczonej ependorfówki umieszczonej w lodzie.
#Dodać 70 μl 10% (w/v) roztworu siarczanu streptomycyny i delikatnie wymieszać.
#Zwirować mieszaninę 30 min, 12 000g, 4 °C.
#Supernatant zawierający białko przenieść do nowej oznaczonej falkonówki.
#Zrównoważyć kolumienki wirownicze z Ni-NTA buforem do lizy — nalać na kolumienkę 600 ul buforu i wirować przez min. 4 minuty przy 2900 rpm (około 890g).
#Nałożyć supernatant na zrównoważoną buforem kolumienkę wirowniczą.
#Zwirować kolumienkę (5 minuty, 1600 rpm = 270g). Zachować eluat do analizy elektroforetycznej w oznaczonej ependorfówce (A).
#Nalać na kolumienkę 600 ul buforu do mycia i zwirować kolumienkę (2 minuty, 2900 rpm = 890g). Zachować eluat do analizy elektroforetycznej w oznaczonej ependorfówce (B).
#Powtórzyć czynności opisane w punkcie 14.Zachować eluat do analizy elektroforetycznej w oznaczonej ependorfówce (C).
#Nałożyc na kolumienkę 300 ul buforu do elucji i zwirować kolumienkę (2 minuty, 2900 rpm = 890g). Zabrać eluat z oczyszczonym białkiem do ependorfówki. Zachować eluat do analizy elektroforetycznej w oznaczonej ependorfówce (D).
#Powtórzyć czynności opisane w punkcie 16. Zachować eluat do analizy elektroforetycznej w oznaczonej ependorfówce (E).
#Schować podpisane ependorfówki do zamrażarki.

==V spotkanie: Kontrola jakości oczyszczania białka metodą elektroforezy denaturującej (patrz również spotkanie III)==

===Odczynniki niezbędne do wykonania ćwiczenia III===
*Odczynniki do przygotowania żeli:
**30% roztwór akrylamidów,
**woda dejonizowana,
**TEMED,
**10% APS,
**1.5 M bufor Tris-HCl, pH 8.8,
**0.5 M Tris-HCl, pH 6.8,
**10% SDS;
*barwnik denaturujący do białek (5x stężony),
*bufor glicynowy do elektroforezy SDS-PAGE 1x stężony,
*barwnik do barwienia żelu po elektroforezie (BioRad),
*etanol do mycia szybek elektroforetycznych,
*elektroforetyczny marker białkowy.
===Przygotowanie i przeprowadzenie elektroforezy===
====Przygotowanie żelu poliakrylamidowego====
#Starannie umyć szybki elektroforetyczne wodą, wytrzeć ręcznikiem papierowym i przetrzeć wewnętrzne powierzchnie etanolem.
#Każda z osób składa ze sobą dwie syzbki.
#Złożone szybki spiąć klamrami i zamocować na podstawce.
#Sporządzić roztwór żelu separującego (dolnego) o odpowiednim stężeniu (według Tab.1).
#Szybko wlać mieszaninę pomiędzy płytki szklane do takiej wysokości, żeby zostawić miejsce na około 1 cm żelu górnego i grzebień.
#Po wylaniu żelu upewnić się, że nie ma w nim bąbli powietrza.
#W celu odcięcia dostępu tlenu przeszkadzającego polimeryzacji na żel nalać ostrożnie 1-2 mm wody. Pozostawić do polimeryzacji (45 minut).
#Po spolimeryzowaniu żelu separującego przygotować żel ściągający według Tab.1.
#Szybko zlać wodę z nad żelu dolnego i osuszyć ręcznikiem papierowym.
#Natychmiast wlać mieszaninę pomiędzy płytki szklane do ich górnej granicy. Uważać aby nie powstały pęcherzyki powietrza.
#Ostroznie włożyć grzebień.
#Pozostawić do polimeryzacji (30 - 45 minut).

====Przygotowanie układu do elektroforezy====
<ol><li>Zdjąć złożone szybki z żelem z podstawki i wstawić do aparatu do elektroforezy.
<li>Zalać żel buforem glicynowym (1 x stężonym).
<li>Wyjąć ostrożnie grzebień z żelu.
<li>Za pomocą pipety automatycznej usunąć pęcherzyki powietrza z dolnej części żelu.</ol>

====Przygotowanie i nanoszenie próbek====
<ol><li>Przygotować łaźnię wodną lub włączyć blok grzejny i nastawić temperaturę na 95°C.
<li>Rozmrozić ependorfówki z zamrożonymi po hodowli próbkami elektroforetycznymi.
<ol type="A">
<li>Eluat w buforze do lizy po nałożeniu białka na kolumnę.
<li>Eluat w buforze do mycia — I.
<li>Eluat w buforze do mycia — II.
<li>Oczyszczone białko po pierwszej elucji.
<li>Oczyszczone białko po drugiej elucji.</ol>
<li>Po rozmrożeniu pobrać do oznaczonych ependorfówek po 20 <math>\mu</math>l próbki.
<li>Dodać bufor barwiąco-denaturujący (20 <math>\mu</math>l).
<li>Inkubować we wrzącej łaźni wodnej lub bloku grzejnym przez 5 min.
<li>Zwirować przygotowane próbki.
<li>Nanieść po 30 <math>\mu</math>l każdej z próbek do studzienek w żelu przy pomocy pipety automatycznej.
<li>Do jednej ze studzienek nanieść marker otrzymany od asystenta. Marker ma taki sam skład, jak używany na III spotkaniu.
<li>Zanotować położenie próbek na żelu. </ol>

===Wykonanie elektroforezy===
#Przeprowadzić elektroforezę wstępną przy napięciu 100-120 V. Po wniknięciu próbek w żel separujący zwiększyć napięcie do 150-160 V.
#Po skończonym rozdziale odłączyć napięcie, wylać bufor i wyjąć żel z aparatu.

===Barwienie żelu i dokumentacja. ===
#Ostrożnie oddzielić szyby, wyjąć żel i za pomocą szpatułki przenieść do pojemnika
#Do pojemnika wlać ostrożnie wodę
#Płukać przez 5 minut.
#Wylać wodę z pojemnika
#Czynności 2-4 powtórzyc dwukrotnie
#Nalać do pojemnika z żelem barwnik.
#Zostawić żel w barwniku na ok. 15 minut
#Zlać barwnik do pojemnika
#Nalać do kuwety ostrożnie wodę i płukać przez 30 minut.
#Wylać wodę
#Nalać świeżą porcję wody i płukać żel na kołysce
#Nastepnego dnia po odbarwieniu żeli asystenci wykonują ich fotografie i wysyła studentom.
#Po otrzymaniu fotografii żelu należy przeprowadzić jego analizę:<ol type="a"><li>umieścić zdjęcie żelu wraz z opisem,<li>wyznaczyć ruchliwość względną (Rf) białek wzorcowych,<li>wykonać wykres zależności drogi migracji od logarytmu masy,<li>Wyznaczyć masę cząsteczkową białka.</ol>
==VI spotkanie: Określenie stężenia białka metodą spektrofotometryczną i Bradford==
===Materiały niezbędne do wykonania ćwiczenia===
*Bufor fosforanowy 50 mM pH 8.0,
*1 M roztwór NaOH,
*odczynnik Bradforda,
*albumina wołowa o stężeniu 1 mg/ml.
===Metoda spektrofotometryczna===
<ol><li>Usunąć imidazol wykonać dwu lub trzykrotna dializę względem buforu fosforanowego 20 mM, pH 8, 200 mM NaCl.
<li>Do kuwety nalać 2 ml buforu fosforanowego o pH 8, zmierzyć wartość absorpcji w 280 nm, wynik zapisać
<li>Dodać 5 ul próbki oczyszczonego białka i zmierzyć absorpcję.
<li>Pomiar powtórzyć trzykrotnie.
<li>Wyznaczyć stężenie białka stosując prawo Lamberta-Beera i korzystając z podanej przez asystenta wartości współczynnika ekstynkcji. Dane zapisać w tabeli.</ol>
===Metoda Bradford ===
<ol><li>Z wyjściowego roztworu surowiczej albuminy bydlęcej o stężeniu 1 mg/ml sporządzić dla całej grupy rozcieńczenia według Tab. <xr id="fig:2"/>.
<li>Uzyskany zestaw stężeń należy podzielić na ilość osób wykonujących ćwiczenie.
<figure id="fig:2">
{|class="wikitable"
!Stężenie wyjściowego roztworu białka (mg/ml)
!Objętość wyjściowego roztworu białka (ml)
!Objętość H2O (ml)
!Stężenie wzorcowego roztworu białka (mg/ml)
!Objętość wzorcowego roztworu białka (ml)
|-
|1
|1
|0
|1
|1
|-
|1
|0,75
|0,25
|0,75
|1
|-
|1
|0,5
|0,5
|0,5
|1
|-
|1
|0,25
|0,75
|0,25
|1
|-
|1
|0,2
|1,8
|0,1
|2
|-
|0,1
|0,75
|0,25
|0,075
|1
|-
|0,1
|0,5
|0,5
|0,05
|1
|-
|0,1
|0,25
|0,75
|0,025
|1
|-
|0,1
|0,1
|0,9
|0,01
|1
|}
</figure>
<li>Do ependorfówek dodać po 0,02 ml roztworów białka wzorcowego o stężeniach: 1; 0,75; 0,5; 0,25; 0,1; 0,075; 0,05; 0,025; 0,01 mg/ml (dwa powtórzenia dla każdego stężenia BSA) i po 0.98 ml odczynnika Bradforda.
<li>Do ependorfówek dodać po 0,02 , 0,04 i 0,06 ml próbki białka, której stężenie chcemy ocenić i odpowiednio po 0.98, 0,96 i 0,94 ml odczynnika Bradforda.
<li>Całość natychmiast energicznie wymieszać i pozostawić na 5 minut. Równolegle przygotować próbę kontrolną przez zmieszanie 0,02 ml H2O z 0,98 ml odczynnika Bradforda.
<li>Wykonać pomiary absorbancji dla wszystkich próbek, łącznie z kontrolną, przy długości fali 595 nm.
<li>Wykreślić krzywą wzorcową jako zależność pomiędzy stężeniami białka a wartościami absorbancji.
<li>Umieścić na krzywej wzorcowej absorpcję odczytaną w 595 nm dla badanej próbki białka i odczytać stężenie.</ol>
Porównać stężenia bialka uzyskane metodą Bradford oraz spektrofotometryczną. Wyniki przedyskutować.

Pracownia Biologii Molekularnej II/Plan ćwiczeń - Historia wersji

Annach: Utworzono nową stronę "Pracownia Biologii Molekularnej Część II Plan ćwiczeń wykonywanych w ramach Pracowni Biologii Molekularnej, część II — Ekspresja i oczysz..."