Annach: Utworzono nową stronę "Denaturacja albuminy z krwi wołu pod wpływem chlorowodorku guanidyny — pomiary fluorescencyjne (dr Anna Modrak-Wójcik) == Wstęp== Badania procesów z..."

2015-05-22T13:23:52Z

Utworzono nową stronę "<b>Denaturacja albuminy z krwi wołu pod wpływem chlorowodorku guanidyny — pomiary fluorescencyjne </b> (dr Anna Modrak-Wójcik) == Wstęp== Badania procesów z..."

Nowa strona

<b>Denaturacja albuminy z krwi wołu pod wpływem chlorowodorku guanidyny — pomiary fluorescencyjne </b> (dr Anna Modrak-Wójcik)

== Wstęp==
Badania procesów zwijania i rozwijania białek stanowią ważną grupę zagadnień biofizyki molekularnej. W przypadku większości białek, przyjęcie prawidłowej (natywnej) struktury przestrzennej jest konieczne dla pełnienia specyficznej funkcji biologicznej. Alternatywna konformacja zwykle prowadzi do powstania cząsteczki o odmiennych właściwościach, która może być toksyczna dla organizmu. U podłoża wielu chorób (np. mukowiscydozy czy chorób neurodegeneracyjnych) leży zaburzenie procesu zwijania się białek, często prowadzące do powstawania agregatów (włókna amyloidowe).

Denaturacja to proces prowadzący do zniszczenia struktury II, III- i IV-rzędowej białka natywnego i utraty aktywności biologicznej makrocząsteczki. Sekwencja aminokwasowa jest zachowana, gdyż czynniki denaturujące zaburzają oddziaływania stabilizujące strukturę przestrzenną białka – wiązania wodorowe, mostki solne, oddziaływania hydrofobowe, wiązania disiarczkowe. Denaturację mogą wywołać zarówno czynniki fizyczne (ogrzewanie, wytrząsanie, naświetlanie promieniowaniem UV, jonizującym, rentgenowskim), jak i chemiczne (kwasy, zasady, jony metali ciężkich, mocznik, chlorowodorek guanidyny). Mocznik oraz chlorowodorek guanidyny (Rys. <xr id="fig:1"/>) należą do grupy związków chaotropowych (ang. chaotrope — czyniący chaos). Powodują silne zaburzenie sieci wiązań wodorowych, co skutkuje destabilizacją struktury białka i jego denaturacją. Obecność chlorowodorku guanidyny o stężeniu 6 M niszczy trzeciorzędową i drugorzędową strukturę białek, a większość z nich przybiera w tych warunkach formę kłębka statystycznego (random coil). Chlorowodorek guanidyny jest najczęściej wykorzystywanym czynnikiem denaturującym w badaniach mechanizmu zwijania się białek.

[[File:Guanidinium_chloride_V.2.svg|thumb|<figure id="fig:1"/>Struktura chlorowodorku guanidyny]]
Proces denaturacji białek może być obserwowany przy użyciu różnych technik eksperymentalnych, takich jak spektroskopia absorpcyjna i emisyjna w zakresie UV/Vis, dichroizm kołowy czy NMR. Pomiary fluorescencyjne wyróżniają się wysoką czułością
i specyficznością.

== Właściwości fluorescencyjne białek==
Za absorpcję i fluorescencję białek w zakresie UV odpowiedzialne są aminokwasy aromatyczne: tryptofan (Trp), tyrozyna (Tyr) i fenyloalanina (Phe). Związki te posiadają pierścienie ze sprzężonym układem węglowych wiązań podwójnych typu π (Rys. <xr id="fig:2"/>),
co powoduje zmniejszenie różnicy energetycznej między poziomami π i π* i wzrost prawdopodobieństwa przejść π→ π* i π*→ π.

<figure id="fig:2">
{|class="wikitable"
|[[File:L-Tryptophan_-_L-Tryptophan.svg‎|195px]]
|[[File:L-tyrosine-skeletal.png|150px]]
|[[File:Fenyloalanina.svg|150px]]
|-
|tryptofan
|tyrozyna
|fenyloalanina
|}
<caption>Wzory strukturalne aminokwasów aromatycznych</caption>
</figure>

Maksimum absorpcji tryptofanu przypada w 278 nm (Rys. <xr id="tab:1"/>, Rys. <xr id="fig:3"/>). Położenie maksimum emisji silnie zależy od
polarności rozpuszczalnika, w roztworach wodnych wynosi ok. 355 nm, w
solwentach niepolarnych przesuwa się w stronę krótszych fal. Tyrozyna
posiada maksimum absorpcyjne w 274 nm, a położenie pasma emisji
(maksimum w 303 nm) nie zależy od polarności otoczenia. Fenyloalanina
charakteryzuje się najbardziej krótkofalowym widmem absorbcji i
emisji, z maksimum odpowiednio w 260 i 280 nm i najniższą wydajnością
kwantową (Rys. <xr id="tab:1"/>, Rys. <xr id="fig:3"/>). Spośród widm absorbcji
aminokwasów aromatycznych, widmo absorpcji tryptofanu sięga
najdłuższych fal. Umożliwia to selektywne wzbudzanie fluorescencji
reszt tryptofanowych w białkach (dla wzbudzeń powyżej 295 nm).

<figure id="tab:1"><caption>Parametry spektralne aminokwasów aromatycznych w roztworze wodnym, pH 7,0</caption>
{|class="wikitable"
!aminokwas
!absorpcja <math>\lambda_{\mathrm{max}}</math> [nm]
!<math>\varepsilon(\lambda_{\mathrm{max}})</math> [M-1cm-1]
!emisja <math>\lambda_{\mathrm{max}}</math> [nm]
!wydajność kwantowa
|-
|Phe
|258
|200
|282
|0,02
|-
|Tyr
|274
|1400
|303
|0,14
|-
|Trp
|278
|5600
|355
|0,13
|}
</figure>

Absorpcja i fluorescencja białek jest zdominowana przez tryptofan. Po
pierwsze, tryptofan posiada najwyższy współczynnik ekstynkcji spośród
trzech aminokwasów aromatycznych (Rys. <xr id="tab:1"/>). Po drugie,
pomimo że wydajności kwantowe tyrozyny i tryptofanu w roztworze są
podobne, w białkach natywnych emisja pochodząca od tyrozyny jest
często wygaszana, przede wszystkim w wyniku bezpromienistego
rezonansowego przeniesienia energii (FRET, ang. Förster resonance
energy transfer) między tyrozyną a tryptofanem.

Ze względu na mały współczynnik ekstynkcji i niską wydajność kwantową
fenyloalaniny (w białku dodatkowo obniżoną przez FRET między Phe i Tyr
lub Trp), fluorescencja Phe jest obserwowana praktycznie tylko w
przypadku braku w sekwencji aminokwasowej białka pozostałych dwóch
aminokwasów aromatycznych.

[[Plik:Widma absorbcji i fluorescencji aminokwasów aromatycznych.png|thumb|300px|center|<figure id="fig:3"/> Widma absorbcji i fluorescencji aminokwasów aromatycznych: fenyloalaniny (Phe), tyrozyny (Tyr) i tryptofanu (Trp) w roztworach wodnych o pH 7,0. Widma zostały unormowane do jedności w maksimach.]]

FRET jest zjawiskiem przekazania energii między pierwotnie wzbudzonym
donorem a niewzbudzonym akceptorem. Przekazanie energii zachodzi bez
emisji fotonu, na skutek długozasięgowego oddziaływania dipol-dipol z
udziałem donora i akceptora. Wydajność tego procesu zależy między
innymi od stopnia nakładania się widma emisji donora i absorpcji
akceptora oraz od odległości donor-akceptor. Odległości, które
pozwalają na zajście FRET są porównywalne z rozmiarami makrocząsteczek
biologicznych (20-60 Å). Ze względu na częściowe przekrywanie się
widma fluorescencji fenyloalaniny z widmem absorpcji tyrozyny i
tryptofanu oraz widma fluorescencji tyrozyny z widmem absorpcji
tryptofanu (Rys. <xr id="fig:3"/>) w białkach często mamy do czynienia z
bezpromienistym przeniesieniem energii pomiędzy fenyloalanią a
tyrozyną lub tryptofanem oraz pomiędzy tyrozyną i tryptofanem.

Spektroskopia emisyjna jest doskonałym narzędziem do badania procesu
denaturacji białek. Emisyjne właściwości reszt tryptofanowych w
białkach natywnych (położenie maksimum widma emisji, wydajność
kwantowa) silnie zależą od ich od lokalnego otoczenia. Białka
posiadające reszty tryptofanowe w otoczeniu hydrofilowym mają maksimum
emisji zbliżone do maksimum emisji tryptofanu w roztworze
wodnym. Maksimum przesuwa się w kierunku fal krótszych wraz
odizolowaniem reszt od środowiska wodnego (do 330-340
nm). Różnorodność tę znosi denaturacja, w wyniku której wszystkie
reszty aminokwasowe mają kontakt z rozpuszczalnikiem (random
coil). Rozwinięcie białka prowadzi także do wzrostu odległości między
resztami aminokwasowymi, między którymi zachodziło bezpromieniste
przeniesienie energii (FRET). W związku z tym, jeśli w sekwencji
aminokwasowej obecne są tyrozyny, w widmie emisji białek
zdenaturowanych, oprócz piku tryptofanowego, często pojawia się pasmo
pochodzące od tyrozyn.

[[File:ALB_structure.png|thumb|200px|<figure id="fig:4"/> Struktura krystalograficzna ludzkiej albuminy]]
Podczas ćwiczenia zbadasz proces rozwijania albuminy z krwi wołu (BSA)
pod wpływem chlorowodorku guanidyny. Albumina jest głównym białkiem
występujący w osoczu krwi. Zawiera 583 aminokwasy, w tym 2 tryptofany
i 20 tyrozyn. Jeden z tryptofanów znajduje się w otoczeniu silnie
hydrofobowym, drugi jest wyeksponowany do roztworu. Ponad 67%
struktury drugorzędowej BSA to α-helisy. Główną jej funkcją jest
transport kwasów tłuszczowych i metabolitów. Rysunek <xr id="fig:4"/> przedstawia
strukturę krystalograficzną ludzkiej albuminy, która przejawia 76%
homologii z BSA.

==Wymagania do kolokwium wstępnego==
# Zjawisko absorpcji i emisji promieniowania elektromagnetycznego.
# Zasada pomiaru absorpcji i fluorescencji, widmo absorbcji, widma emisji i wzbudzenia fluorescencji.
# Budowa białek.
# Oddziaływania stabilizujące strukturę przestrzenną białek.
# Denaturacja białek.
# Właściwości absorpcyjne i emisyjne aminokwasów (wolnych i w białkach), wpływ środowiska.
# Försterowskie rezonansowe przeniesienie energii (FRET).

==Przebieg ćwiczenia ==
Podczas ćwiczenia prześledzisz proces denaturacji albuminy z krwi wołu (BSA)
pod wpływem chlorowodorku guanidyny (GdnHCl). Wykonasz pomiary widm emisji fluorescencji BSA w funkcji stężenia denaturanta dla dwóch różnych wartości fali wzbudzenia (280 i 295 nm) za pomocą spektrofluorymetru Tau-3 (Horiba Jobin Yvon).

Masz do dyspozycji:
* 50 mM bufor Tris-HCl pH 7,2,
* 35 μM roztwór BSA w 50 mM buforze Tris-HCl pH 7,2,
* 6 M roztwór GdnHCl w 50 mM buforze Tris-HCl pH 7,2,
* kwarcową kuwetę fluorescencyjną 0,4 x 1 cm.

<ol><li> Przygotuj roztwory GdnHCl w 50 mM buforze Tris-HCl pH 7,2 poprzez rozcieńczanie stężonego roztworu chlorowodorku guanidyny (6 M) wg poniższego schematu:
# M GdnHCl => 0,75 ml 6 M GdnHCl + 3,75 ml buforu
# M GdnHCl => 1,5 ml 6 M GdnHCl + 3,0 ml buforu
# M GdnHCl => 2,25 ml 6 M GdnHCl + 2,25 ml buforu
# M GdnHCl => 3,0 ml 6 M GdnHCl + 1,5 ml buforu
# M GdnHCl => 3,75 ml 6 M GdnHCl + 0,75 ml buforu
<li> Przygotuj roztwory BSA w 50 mM buforze Tris-HCl pH 7,2 oraz w 50 mM buforze Tris-HCl pH 7,2 zawierającym różne stężenia GdnHCl (1, 2, 3 ,4, 5 i 6 M). Do 1,85 ml odpowiedniego buforu dodaj po 150 μl stężonego BSA (35 μM) i wymieszaj. Pozostaw roztwory w temperaturze pokojowej na około dwie godziny. Ile wynosi stężenie BSA
po rozcieńczeniu?
<li> Kuwetę fluorescencyjną napełnij 1,4 ml 50 mM buforu Tris-HCl pH 7,2. Zarejestruj widma emisji fluorescencji dla wzbudzenia 280 i 295 nm w zakresie odpowiednio 285-500
i 300-500 nm. Szerokości spektralne szczeliny wzbudzającej i emisyjnej ustaw równe 4 nm,
a czas integracji 0,5 s/nm. Widma zarejestruj w modzie s/r (w ten sposób niwelujesz fluktuacje natężenia lampy w czasie oraz różnice w intensywności świecenia lampy
w różnych długościach fali). W analogiczny sposób przeprowadź pomiary dla roztworów GdnHCl. W ten sposób uzyskasz widma emisyjne tła.
<li> Przeprowadź analogiczne pomiary dla roztworów BSA.</ol>

==Opis końcowy==
Opis końcowy powinien zawierać poszczególne elementy charakterystyczne
dla raportu z przebiegu eksperymentu (streszczenie, wstęp teoretyczny, opis układu doświadczalnego oraz wyniki i ich dyskusję).

Wyniki należy opracować korzystając z programu ORIGIN lub PRISM (dostępne
na komputerach w Pracowniach Komputerowych w Zakładzie Biofizyki i w sali 112
w budynku dydaktycznym przy ul. Pasteura 7) i udokumentować za pomocą czytelnych tabel i wykresów.

Opracowanie wyników powinno uwzględniać następujące zagadnienia:
# Analizę i interpretację zależności widm emisji fluorescencji albuminy od stężenia chlorowodorku guanidyny.
# Wyznaczenie zależności położenia maksimum widma emisji BSA od stężenia GdnHCl.
# Wyznaczenie zależności natężenia fluorescencji BSA w 300 i 350 nm (dla wzbudzenia w 280 nm) oraz w 305 i 350 nm (dla wzbudzenia w 295 nm) od stężenia GdnHCl.
Przy opracowywaniu danych pamiętaj o odjęciu tła pochodzącego od rozpuszczalnika.

== Literatura==
# „Biofizyka. Wybrane zagadnienia wraz z ćwiczeniami”, red. Z. Jóźwiak i G. Bartosz, PWN 2007
#„Biochemia”, J. M. Berg, J. L. Tymoczko, L. Stryer, PWN 2009
# „Podstawy spektroskopii molekularnej”, Z. Kęcki, PWN 1998
# „Principles of fluorescence spectroscopy” J.R. Lakowicz

Pracownia Podstaw Biofizyki/PPB4d - Historia wersji

Annach: Utworzono nową stronę "Denaturacja albuminy z krwi wołu pod wpływem chlorowodorku guanidyny — pomiary fluorescencyjne (dr Anna Modrak-Wójcik) == Wstęp== Badania procesów z..."