Pracownia Podstaw Biofizyki/PPB3

Mikroskopia konfokalna — zastosowanie w badaniach układów biologicznych na przykładzie chloroplastów

Wariant 1: wyznaczenie struktury chloroplastów w warunkach naturalnych przy 6 mM stężeniu jonów magnezu (Mg²⁺)

dr hab. Borys Kierdaszuk

Wstęp

W zjawisku fotosyntezy uczestniczą kompleksy białkowo-barwnikowe zlokalizowane na błonach tylakoidalnych w chloroplastach komórek roślinnych. Tylakoidy są wewnętrznymi błonami chloroplastów. Ścieśnione błony tylakoidalne tworzą grana (400-600 nm) i połączenia między granami zwane lamelami. Dotychczasowe badania prowadzone nad poznaniem budowy chloroplastów i procesów związanych z pochłanianiem kwantów światła doprowadziły do dokładnego poznania składu głównych kompleksów fotosyntetycznych (ang. photosyntetic systems, PSI, PSII), kompleksów zbierającego światło (ang. light harvesting complexes, LHCI, LHCII), cytochromu b6f (Cyt b6f) i syntazy ATP. Znane są również mechanizmy przemiany energii świetlnej w chemiczną i podstawowe mechanizmy regulujące proces fotosyntezy.

Współczesna nauka coraz częściej podejmuje próbę odtworzenia rzeczywistych wymiarów i kształtów komórek i poszczególnych struktur wewnątrzkomórkowych oraz powiązania budowy strukturalnej komórki lub organelli z ich funkcją. W ostatnich latach, w związku z zastosowaniem metod tomografii elektronowej i mikroskopii sił atomowych (ang. atomic force microscopy, AFM), rozgorzał spór o przestrzenną budowę błon tylakoidalnych. Istotny przyczynek do opracowania przestrzennych modeli chloroplastów wniosło zastosowanie fluorescencyjnej laserowej konfokalnej mikroskopii skaningowej (ang. confocal laser-scanning fluorescence microscopy, CLSFM) oraz analiza indukowanego stężeniem magnezu procesu tworzenia gran i zmiany w strukturze chloroplastów pod wpływem stresu chłodu. Zaletą stosowania CLSFM w poznawaniu struktur biologicznych jest możliwość obserwacji zmian obiektów nie poddanych zabiegom utrwalania, czyli pomiar struktury biologicznej in situ.

Spadek temperatury, zmiany stężenia tlenu i soli mineralnych to podstawowe środowiskowe czynniki stresowe, które spowodowały powstanie w roślinach mechanizmów reakcji i przystosowania się. W szczególności mechanizmy przystosowawcze dotyczą także elastycznej regulacji reakcji fotosyntetycznych w odpowiedzi na zmienne warunki środowiska i są ściśle powiązane ze zmianami organizacji superkompleksów w błonach tylakoidalnych.

Najlepiej poznany jest wpływ chłodu i stężenia jonów magnezu (Mg²⁺) na własności układów fotosyntetycznych. Chłód powoduje dezintegracje gran i pęcznienie chloroplastów, a także wzrost stężenia wolnych kwasów tłuszczowych, które mają również wpływ na oddziaływania pomiędzy kompleksami fotosyntetycznymi. Następuje zmniejszenie się wydzielania tlenu oraz uwalnianie manganu z kompleksu PSII. Ponadto badania widm emisji fluorescencji błon tylakoidalnych roślin przechłodzonych pokazały nagromadzenie się zagregowanych form LHCII. Powstałe zmiany są częściowo odwracalne poprzez fotoreaktywację pod wpływem oświetlania roślin słabym światłem w optymalnej temperaturze. Naturalne (~4 mM) stężenie kationów Mg²⁺ stabilizuje struktury ścieśnione błon tylakoidowych (Rys. Figure 1), które wraz z jego obniżeniem lub wzrostem stężenia anionów ulegają deagregacji. Związek pomiędzy zmianami w strukturze i przegrupowaniami kompleksów fotosyntetycznych w kontrolowanych warunkach stresowych nie jest jeszcze dobrze poznany.

Różnice między stukturą nienaruszonych (naturalnych) chloroplastów groszku (pea) i fasolki (bean) otrzymaną na podstawie autofluorescencji chlorofilu w buforze C zawierajacym 15 mM NaCl i 4 mM MgCL₂, zmierzonej za pomocą fluorescencyjnej laserowej konfokalnej mikroskopii skaningowej (ang. confocal laser-scanning fluorescence microscopy, CLSFM). Każdy obrazek zawiera wynik rozplatania jednego środkowego obrazka z CLSFM. Skala = 2 μm.

Ćwiczenie dotyczy badań biofizycznych struktury chloroplastów w nieobecności kationów Mg²⁺ w roztworach symulujących ich naturalne środowisko. Celem jest zbadanie struktury przestrzennej chloroplastów za pomocą CLSFM z rozdzielczością optyczną mikroskopu wynikająca z limitu Abbego. Ćwiczenie to obejmuje także samodzielne przygotowanie preparatów na szkiełkach mikroskopowych oraz interpretację wpływu kationów Mg²⁺ na podstawie porównania otrzymanej struktury z tą otrzymaną przez grupę wykonującą pierwszy wariant ćwiczenia.

Wymagania do kolokwium wstępnego

Warunkiem przystąpienia do części eksperymentalnej ćwiczenia jest zaliczenie kolokwium wstępnego. Wybór sposobu przeprowadzenia kolokwium wstępnego tj. forma pisemna czy ustna, pytania otwarte czy zamknięte — należy do prowadzącego ćwiczenie.

Materiał z zakresu fluorescencyjnej laserowej konfokalnej mikroskopii skaningowej (CLSFM) obowiązujący w czasie kolokwium wstępnego i wykonywania ćwiczenia, przedstawiony został podczas wykładów „Spektroskopia molekularna” i „Fizyka atomów, cząsteczek i makrocząsteczek biologicznych”, a pewne jego rozszerzenie bądź ilustracja konkretnych zagadnień szczegółowych zawarta jest w dołączonej publikacji (Załącznik 1) oraz opisie struktury optyki konfokalnej w typowym mikroskopie konfokalnym (Załącznik 2):

Zagadnienia, które mogą pojawić się podczas kolokwium wstępnego:

1. Absorpcja i emisja fotonów w przypadku cząsteczek biologicznych.
2. Porównanie energii, częstości i długości fali fotonów absorbowanych i emitowanych przez dany fluorofor. Czynniki wpływające na emisję fotonów.
3. Rola kompleksów chlorofilowo-białkowych w fotosyntezie.
4. Rejestracja widma emisji i wzbudzenia fluorescencji.
5. Zakresy długości fali pasm absorpcji oraz pasm emisji i wzbudzenia fluorescencji błon tylakoidowych i chloroplastów. Fluorofory odpowiedzialne za absorpcję i emisję fotonów w chloroplastach.
6. Idea pomiarów za pomocą fluorescencyjnej laserowej konfokalnej mikroskopii skaningowej. Rola światła laserowego.
7. Pomiar konfokalny.
8. Metody skanowania przestrzennego.
9. Limit Abbego.
10. Zalety mikroskopu konfokalnego w porównaniu z mikroskopem niekonfokalnym.

Wykonanie ćwiczenia

Przygotowanie próbek chloroplastów na szkiełkach mikroskopowych

Nienaruszone chloroplasty są izolowane poprzez homogenizację liści groszku lub fasolki w zmrożonym buforze A (20 mM Tricine-NaOH, pH 7.5) zawierającym 330 mM sorbitol, 15 mM NaCl, 4 mM MgCL₂ i 40 mM askorbinianu. Po homogenizacji roztwór należy przesączyć przez czterokrotnie złożoną fizelinę. Przesącz jest wirowany przy 2000g przez 3 minuty. Homogenizację i sączenie wykonuje się w chłodni, a wirowanie schłodzonej do 4 °C wirówce. W miarę możliwości materiał biologiczny należy trzymać w ciemności by uniknąć foto-uszkodzeń barwników. Otrzymany w ten sposób osad należy ostrożnie rozprowadzić w jak najmniejszej ilości buforu B (20 mM HEPES-NaOH pH 7.0) zawierającym 330 mM sorbitol, 15 mM NaCl i 4 mM MgCL₂, a następnie natychmiast użyć w konfokalnym mikroskopie skaningowym (CLSM) do pomiaru (niżej). Chloroplasty uszkodzone (~20%) należy pominąć w badaniu CLSM. Stężenie chlorofilu (Chl) należy zmierzyć spektrofotometrycznie po ekstrakcji 25 ml roztworu chloroplastów w 80% acetonie w wodzie. Absorbancję należy zmierzyć w kuwecie 10x10 mm przy 652 nm wobec 80% acetonu jako roztworu odniesienia. Uwzględniając rozcieńczenie podczas ekstrakcji i współczynnik ekstynkcji z prawa Lamberta-Beera, stężenie Chl (mg/ml) otrzymujemy po pomnożeniu absorbancji przez współczynnik 11.6 mg/ml. Izolacja chloroplastów jest wykonywana w Instytucie Biochemii (Wydział Biologii UW). Potrzebne odczynniki i drobny sprzęt zostały zakupione z projektu badawczego.

Pomiary laserowej konfokalnej fluorescencyjnej mikroskopii skaningowej CLSFM oraz rekonstrukcja struktury przestrzennej chloroplastów

Izolowane nienaruszone chloroplasty (~30 μg Chl ml^-1) zawiesić w buforze C (20 mM HEPES-NaOH, pH 7.5) zawierającym 330 mM sorbitol, 6% (v/v) glycerol, 30 μM DCMU (specyficzny inhibitor fotosyntezy blokujący miejsce wiązania plastochinonu w PSII) oraz 6 mM MgCL₂. Po 10-minutowej inkubacji na lodzie w ciemnościach 15 μl zawiesiny umieścić na warstwie poly-L-lizyny (1 mg/ml) imobilizowanej na szkiełku mikroskopowym. Wykonać obrazowanie próbek za pomocą konfokalnego fluorescencyjnego mikroskopu skaningowego (Nikon Eclipse Ti A1) wyposażonego w laser diodowy ([math]\lambda_\mathrm{exc}[/math] 561.2 nm) i obiektyw olejowy Plan APOchromate VC 100x z aperturą NA 1.4. Emisja fluorescencji w mikroskopie jest zbierana za pomocą filtru 662-777 nm w zakresie emisji PSII, przy aperturze konfokalnej ustawionej na około jedną jednostkę Airego. Każdy preparat należy uważnie obejrzeć pod mikroskopem w świetle przechodzącym aby zlokalizować wyglądający na nienaruszony chloroplast. Rejestrowane są skany względem osi Z (optyczne warstwy 79-298 sztuk) stosując dodatkowe powiększenie 8x zawierające 512 x 512 pikseli i 12-bitowy kolor. Do analizy brane są skany tych chloroplastów, które mają kształt spłaszczonych kulek i nie są uszkodzone przez silne światło wzbudzające. Można je obejrzeć za pomocą programu NIS-Elements (Nicon). Po wykonaniu pomiarów, celem poprawienia relacji sygnał-szum sygnał emisyjny od chloroplastów jest rozplatany za pomocą programu AutoQuantX (Media Cybernetics) korzystając z domyślnych ustawień dla funkcji z którą następuje splot (point spread function). Program określa jaki byłby sygnał dyspersji od fluoroforów zlokalizowanych w hipotetycznych położeniach i odejmuje go od obrazu — po czym w kolejnych powtórzeniach stara się lepiej zlokalizować skupiska fluoroforów. Następnie dla tak przygotowanych plików danych, za pomocą programu Imaris (Bitplane) generowane są trójwymiarowe struktury przestrzenne chloroplastów (surface objects) z przykładowymi ustawieniami: surface area detail 0.03 μm, local contrast 0.1 μm, treshold 100, number of voxels 200. Działanie programu polega na objęciu wspólna powierzchnią sąsiadujących obszarów wykazujących silną fluorescencję. Powinno to w przybliżeniu odtworzyć strukturę błon (gran), w których zawarte są fotosystemy PSII. Pomiary i rekonstrukcje struktury przestrzennej są wykonywane odpowiednio w Pracowni Mikroskopowej i w Zakładzie Regulacji Metabolizmu (Instytutu Biochemii UW).

Wyniki

1. Przygotować próbki chloroplastów w obecności 6 mM jonów magnezu (Mg²⁺) na szkiełkach mikroskopowych według opisanej wyżej procedury.
2. Wykonać pomiary CLSFM na uprzednio przygotowanej aparaturze.
3. Stosując odpowiednie oprogramowanie wykonać rekonstrukcję struktury przestrzennej chloroplastów.
4. Porównać otrzymaną strukturę z tą otrzymaną przez grupę wykonującą drugi wariant tego ćwiczenia oraz zinterpretować wpływ kationów Mg²⁺.