Metody Biofizyki Molekularnej/Ultrawirowanie analityczne

Ultrawirowanie analityczne należy do grupy technik umożliwiających badanie zachowania się makrocząsteczek w roztworze. Podczas ultrawirowania analitycznego biomolekuły są charakteryzowane w stanie natywnym w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, bez zaburzających oddziaływań ze złożami.

Zjawisko sedymentacji

W trakcie ultrawirowania biomolekuł zachowują się podobnie jak cząsteczki zawiesin makroskopowych w procesie sedymentacji, czyli osiadania w polu grawitacyjnym wywołanego różnicą gęstości fazy rozproszonej i ośrodka dyspersyjnego.

Proces sedymentacji zawiesin makroskopowych w polu grawitacyjnym wygląda następująco:

• bezpośrednio po zakończeniu mieszania stężenie zawiesiny jest jednakowe w każdym naczyniu,
• na skutek opadania cząstek zawiesiny górna część płynu nie zawiera zawiesiny, a na dnie pojawia się osad,
• w miarę upływu czasu granica ta przesuwa się ku dołowi, rośnie również grubość osadu na dnie,
• proces osiadania cząstek można przyspieszyć poprzez wirowanie.

Na szybkość sedymentacji ma wpływ:

• różnica gęstości pomiędzy cząstkami zawiesiny a cieczą,
• lepkość płynu decydująca o tarciu pomiędzy cząstkami zawiesiny a płynem.

W przypadku zawiesiny makrocząsteczek biologicznych w polu grawitacyjnym nie obserwujemy zjawiska sedymentacji. Dopiero gdy poddamy próbkę działaniu sił odśrodkowych setki lub tysiące razy większych niż siła grawitacyjna przeciwdziałających siłom wyporu, dyfuzji i flotacji, ulegają one osadzaniu.

Historia

W 1877 roku szwedzki inżynier, Gustaf Carl de Laval wynalazł ręczną wirówkę do uzyskiwania śmietany z mleka i następnie opatentował wynalazek.

W 1908 roku Perrin odkrył zjawisko równowagi sedymentacyjnej w roztworach cząstek gumiguty, rozdzielanych wg rozmiarów poprzez uważne wirowanie, a w 1909 roku opublikował pracę o wyznaczeniu liczby Avogadro metodą pomiarów dyfuzji mikrocząstek. W 1926 roku otrzymał Nagrodę Nobla "for his work on the discontinuous structure of matter, and especially for his discovery of sedimentation equilibrium".

Ultrawirówka zbudowana przez Theodora Svedberga (lata 1920-ste) okazała się jednym z najbardziej owocnych, odpowiednich urządzeń do badań makromolekuł. Svedberg udowodnił, że białka składają się z dużej liczby atomów połączonych wiązaniami kowalencyjnymi i w 1926 roku otrzymał Nagrodę Nobla w zakresie chemii za prace nad układami rozproszonymi.

W 1923 roku pojawiła się pierwsza wirówka z optycznym systemem detekcji.

W 1926 roku wykonano pierwszy pomiar masy cząsteczkowej hemoglobiny i ovalbuminy metodą równowagi sedymentacyjnej.

W 1929 roku Ole Lamm podał równanie opisujące przesuwanie się granicy w polu siły odśrodkowej.

W latach 30-tych XX wieku skonstruowano system optyczny umożliwiający obserwacje gradientu stężenia w funkcji odległości w kuwecie pomiarowej i powiązano parametry wirowania z kształtem i uwodnieniem makrocząsteczek. Od lat 40-tych do końca 60-ych udoskonalano urządzenie, lata 70-te nazwano „złotymi latami” tej techniki pomiarowej.

Z kolei w latach 80-tych ultrawirowanie zaczęło traci popularność ze względu na zastosowanie elektroforezy i chromatografii żelowej wymagających mniejszych ilości materiału, oraz trudną analizę danych na wolno pracujących komputerach.

W latach 90-tych wprowadzono nowy model ultrawirówki, zautomatyzowano sposób zbierania danych i ich analizy. Zainstalowano dwa systemy detekcji (rozpraszanie i absorpcja) w jednej wirówce.

Od 2000 roku ultrawirowanie analityczne przeżywa renesans. Stosuje się je w przypadku różnych badań (czystość próbki, masa, kształt, oddziaływanie z innymi makromolekułami) dla obiektów o szerokim zakresie mas cząsteczkowych (od kilkuset do dziesiątek milionów).

Podstawy fizyczne ultrawirowania analitycznego

Podczas wirowania z prędkością kątową ω na cząsteczkę o masie m działają następujące siły:

1. siła odśrodkowa
   

   [math]F=m\omega 2r=ma=V\rho a[/math]
   

   gdzie: r – odległość od osi obrotu, a- przyspieszenie odśrodkowe, V – objętość cząsteczki, ρ – gęstość cząsteczki.
2. tarcie dynamiczne
   

   [math]T=f\left(\frac{\mathrm dr}{\mathrm dt}\right)[/math]
   

   gdzie: f – współczynnik tarcia, zależny od właściwości cząsteczki oraz lepkości roztworu
3. siła wyporu
   

   [math]W=V\rho_s \omega 2r= V\rho_sa=\frac{ma\rho_s}\rho[/math]
   

   gdzie: [math]\rho_s\;[/math] — gęstość cieczy.
   Warunek równowagi: cząsteczka porusza się ruchem jednostajnym jeśli siła tarcia i siła wyporu równoważą siłę odśrodkową
   [math]F + W + T = 0\;[/math]
   [math]V(\rho-\rho_s)\omega^2r =f\frac{\mathrm dr}{\mathrm dt}F-W[/math]
   czyli:
   [math]V\rho\left(1-\frac{\rho_s}\rho\right)=f\frac 1{\omega^2r}\frac{\mathrm dr}{\mathrm dt}[/math]
   Definiujemy stałą sedymentacji S jako
   [math]S=\frac 1{\omega^2r}\frac{\mathrm dr}{\mathrm dt}[/math]
   Stała sedymentacji wielkością charakteryzującą ruch cząsteczki w rozpuszczalniku równą prędkości sedymentacji na jednostkę przyspieszenia odśrodkowego. Jednostką stałej sedymentacji jest [math]\unit{1}{S\ (swedberg)} = \unit{10^{-13}}s[/math].
   Dalej otrzymujemy:
   [math]V\rho\left(1-\frac{\rho_s}\rho\right)=fS[/math]
   [math]M/\rho\left(1-\frac{\rho_s}\rho\right)=fS N_A[/math]
   gdzie: M — masa cząsteczkowa makrocząsteczki, [math]N_A[/math] — liczba Avogadro, a masa pojedynczej cząsteczki jest równa [math]m = V\rho = \nicefrac M{N_A}[/math].
   Szybkość ruchu cząsteczki opisuje zależność:
   [math]\frac{\mathrm dr}{\mathrm dt}=\frac{V(\rho-\rho_s)a}f[/math]
   

Wyznaczanie masy cząsteczkowej

Korzystając z zależności:

[math]M\left(1-\frac{\rho_s}\rho\right)=fSN_A[/math]

oraz ze wzoru Einsteina na współczynnik dyfuzji:

[math]D=\frac{RT}{fN_A}[/math]

gdzie: R — stała gazowa, T — temperatura [K], otrzymujemy:

[math]M=\frac{RTS}{D\left( 1-\frac{\rho_s}\rho\right)}[/math].

Uwaga:

Często, definiując cząstkową objętość właściwą cząsteczki jako: [math]V_2=\frac1\rho[/math], w powyższych równaniach zastępujemy [math]\nicefrac{\rho_s}\rho[/math] przez [math]V_2\cdot\rho_s[/math]. [math]V_2[/math] odpowiada zwiększeniu objętości w wyniku dodania 1 grama makromolekuł do wody (białka [math]\unit{0,7- 0,75}{\frac{ cm^3}g}[/math], zdenaturowane DNA [math]{0,55}{\frac{ cm^3}g}[/math]).

Równanie Svedberga

[math]M=\frac{RTS}{D(1-V_s\rho_s)}[/math],

M zależy od:

• właściwości fizycznych cząsteczki: S, [math]V_2[/math],
• warunków eksperymentalnych: D, T, ρ,
• stałej fizycznej: R.

Stąd można bezpośredniego wyznaczyć masę M w przeciwieństwie do innych metod doświadczalnych takich jak elektroforeza i chromatografia, które bazują na porównaniu masy cząsteczki z wzorcem (cząsteczkami o znanych masach).

Jak wyznaczamy stałą sedymentacji i masę cząsteczkową substancji rozpuszczonej?

1. Korzystając z definicji stałej sedymentacji, po rozdzieleniu zmiennych i obustronnym scałkowaniu otrzymujemyzależność:
   

   [math]\ln r =S\omega^2 t+\mathrm{const}[/math]
   

   gdzie r — położenie środka granicy pomiędzy roztworem klarownym i zawiesiną, [math]\ln r[/math] zależy liniowo od czasu ze współczynnikiem nachylenia równym [math]S\omega^2[/math].
2. Korzystając z równania Lamma
   Strumień przez powierzchnię wycinka cylindra zawartego we wnętrzu naczynka wirówki opisuje równanie:
   

   [math]J=S\omega^2 rc -D\frac{\mathrm dc}{\mathrm dr}[/math]
   

   Równanie Lamma, wyprowadzone w 1929 roku, opisuje rozkłady stężenia uzyskiwane w czasie wirowania:

   [math]\left(\frac{\mathrm dc}{\mathrm dt}\right) = -\frac 1r\frac{\mathrm d}{\mathrm dr}\left[\omega^2r^2Sc -Dr \frac{\mathrm dc}{\mathrm dr}\right] [/math]
   

   Rozwiązywanie równania Lamma — metoda pochodnej czasowej (program DCDT+ dostępny w sieci) pozwala na wyznaczenie pochodnych czasowych rozkładów stężenia na podstawie radialnych dystrybucji otrzymanych w eksperymencie.
   Następnie, po przeskalowaniu równania i uniezależnienia od czasu otrzymujemy rozkład [math]g(s)[/math] mówiący o populacji cząsteczek o danym współczynniku sedymentacji.
3. Metoda równowagi sedymentacyjnej
   Stan równowagi sedymentacyjnej występuje przy niewielkiej liczbie obrotów (zwykle poniżej 20 000 obr/min). W stanie równowagi sedymentacyjnej substancja rozpuszczona wypełnia całą kuwetę, a jej stężenie wzrasta od menisku do dna kuwety. Z warunków równowagi termodynamicznej można wyprowadzić wzór na masę cząsteczkową substancji rozpuszczonej:
   

   [math]M=\frac{2RT\ln\frac{c_2}{c_1}}{N_A(1-V_s\rho_s)\omega^2(r^2_2-r_1^2)}[/math]
   

   gdzie: [math]c_1[/math] i [math]c_2[/math] stężenia makrocząsteczki w odległości [math]r_1[/math] i [math]r_2[/math] od osi obrotu w stanie równowagi sedymentacyjnej, uzyskiwanej zwykle po kilkudziesięciu godzinach wirowania.
4. Metoda Archibalda
   Niezależnie od stanu osiągnięcia równowagi sedymentacyjnej powierzchnia menisku (a) i dno kuwety (b) to dwa przekroje, przez które nie przemieszczają się sedymentujące cząsteczki. Czyli:
   

   [math]\frac 1{r_ac_a}\left(\frac{\mathrm dc}{\mathrm dr}\right)_a=\frac 1{r_bc_b}\left(\frac{\mathrm dc}{\mathrm dr}\right)_b=\frac{S\omega^2}D[/math]
   

   stąd masa cząsteczkowa biopolimeru odpowiednio przy menisku i przy dnie kuwety:
   

   [math]M_a=\frac{RT\left(\frac{\mathrm dc}{\mathrm dr}\right)_a}{(1-V_s\rho_s)\omega^2r_a^2c_a}\ M_b=\frac{RT\left(\frac{\mathrm dc}{\mathrm dr}\right)_b}{(1-V_s\rho_s)\omega^2r_b^2c_b}[/math]
   

   dla mieszaniny polimerów [math]M_a \neq M_b\;[/math].

Wirówki i ultrawirówki

Wirówki można podzielić ze względu na

• uzyskiwaną liczbę obrotów:
  • niskoobrotowe — do 5 000 obr/min,
  • średnioobrotowe — do 20 000 obr/min,
  • ultrawirówki — powyżej 20 000 obr/min.
• Przeznaczenie:
  • analityczne,
  • preparatywne,
  • specjalnego przeznaczenia.

Wirówki i ultrawirówki wyposażone są w układy termostatujące umożliwiające kontrolę temperatury z dokładnością do 0,1 stopnia. W ultrawirówkach i wirówkach średnioobrotowych rotor jest umieszczony w komorze próżniowej, aby wyeliminować jego nagrzewanie się. Jeżeli wirowanie odbywa się w próżni próbki muszą być hermetycznie zamknięte. Wirowanie w ultrawirówkach może odbywać się z prędkością 60000 rpm, co odpowiada przyspieszeniu równemu 290 000 g.

Typy rotorów:

• rotor horyzontalny,
• rotor analityczny,
• rotor kątowy.

Mieszaninę poddawaną wirowaniu umieszcza się w odpowiednich pojemnikach. W przypadku wirówek są to kubki wirownicze, a w przypadku ultrawirówek specjalne kuwety analityczne, wytrzymujące wysokie przeciążenia, skręcane przed pomiarami.

Kuweta analityczna składa się z metalowego korpusu oraz rdzenia z tworzywa ze zbiorniczkiem sektorowym zamkniętym z dwóch stron przez okienka kwarcowe. W połowie wysokości kuwety znajduje się otwór do jej napełniania. Istnieje kilka podstawowych typów kuwet analitycznych, np.: kuweta jedno- dwu- lub sześciosektorowa. Przykładowo kuweta dwusektorowa złożona jest z dwóch zbiorniczków, z których jeden jest napełniany badanym roztworem, a drugi rozpuszczalnikiem. Taka kuweta pozwala rejestrować sedymentację badanego roztworu na tle rozpuszczalnika.

Systemy detekcji

1. System interferencyjny.
2. System detekcji absorpcyjnej.

System detekcji oparty na interferencji Rayleigha

1. Monochromatyczne światło przechodząc przez dwie równoległe szczeliny dwusektorowej kuwety zawierającej odpowiednio próbkę i bufor odniesienia ulega interferencji dając w wyniku ciemne i jasne prążki.
2. Jeśli gęstość próbki jest większa niż buforu odniesienia fala przechodząca przez próbkę jest opóźniona względem fali przechodzącej przez bufor odniesienia.
3. Prążki przesuwają się prostopadle proporcjonalnie do różnicy stężeń pomiędzy próbką a buforem odniesienia.

System detekcji oparty o interferencję Rayleigha umożliwia:

1. Pomiar stężenia próbki na podstawie zmian współczynnika odbicia.
2. Nieselektywny, pomiar całości materiału we wiązce.
3. Analizę makrocząsteczek nie zawierających chromoforów (np. polisacharydy, węglowodory).
4. Analizę próbek, które zawierają silnie absorbujące składniki buforu (np. ATP / GTP, DTT_utleniony).
5. Jest to dobry system optyczny w przypadku bardzo stężonych próbek t.j. 100 mg/ml i dużych kompleksów.

System detekcji absorpcyjnej

1. Wykorzystuje zjawisko absorpcji promieniowania o określonej długości fali przez cząsteczki posiadające właściwości absorpcyjne.
2. Lampa ksenonowa o zakresie 190 – 800 nm błyska z częstotliwością zgodna z prędkością obrotu rotora.
3. Zmienna intensywność świecenia lampy jest normalizowana poprzez próbkowanie niewielkiej części światła padającego na detektor.
4. Istnieje możliwość przeskanowania pełnego widma absorpcyjnego próbki dla ustalonego położenia radialnego.

System detekcji absorpcyjnej

1. Jest dobrym wyborem dla cząsteczek zawierających chromofory np. dla białek, DNA, etykietowanych i innych.
2. Czułość od ok. 1 µg/ml.
3. System selektywny - wybór długości fali obserwacji.
4. Dla próbek złożonych możliwość monitorowania kilku składników dzięki obserwacjom absorpcji dla różnych długości fali w tym samym eksperymencie.

Obydwa systemy detekcji umożliwiają wyznaczenie [math]c(r)\;[/math], czyli stężenia w funkcji promienia.

Eksperymenty ultrawirowania analitycznego

Wymagania

• Próbka w roztworze.
• Masa molekularna od setek do kilku milionów daltonów.
• Około 20 µl-300 µl objętości próbki.
• Stężenie próbki w zakresie od 1µg/ml do 50 mg/ml.

Typy eksperymentów

(prędkości sedymentacji i równowagi sedymentacyjnej)

Eksperyment prędkości sedymentacji

Umożliwia wyznaczenie:

• Heterogeniczności próbki.
• Kształtu i wielkości cząsteczek lub kompleksów molekularnych oraz ich zmian.
• Współczynnika sedymentacji.
• Współczynnika dyfuzji.
• Współczynnika tarcia.
• Masy cząsteczkowej.
• Stabilności próbki.

Eksperyment prędkości sedymentacji prowadzi się przy dużych szybkościach rotacji, co prowadzi do przemieszczania się (sedymentacji) cząsteczek substancji rozpuszczonej w dół komórki pomiarowej i wytworzenia gradientu stężenia w kierunku radialnym, zwanego granicą (boundary).

Ponieważ istnienie granicy jest związane z gradientem stężenia to również i granica sedymentuje z upływem czasu. Z uwagi na wzrastające stężenie substancji poniżej granicy, “siły” dyfuzji działają coraz efektywniej prowadząc do rozmywania się granicy (kolejne rejestrowane profile są bardziej pochyłe).

Eksperyment równowagi sedymentacyjnej

Pozwala na wyznaczenie:

• Masy molekularnej, masy składników słabo oddziałujących kompleksów, masy podjednostek.
• Stechiometrii w roztworze.
• Stałej asocjacji.
• Heterogeniczności próbki.

W eksperymencie równowagi sedymentacyjnej szybkość wirowania jest tak mała, że procesy dyfuzji skutecznie przeciwstawiają się procesom sedymentacji i ustala się równowagowy rozkład stężenia molekuł w komórce pomiarowej.

Zalety pomiarów techniką ultrawirowania analitycznego

• Zastosowanie do wszystkich nano i mikrocząsteczek.
• Brak oddziaływań z matrycami — brak artefaktów.
• Technika nie wymaga standardów.
• Heterogeniczne układy są dobrze rozseparowywane.

Analiza danych uzyskanych podczas wirowania

Program [http:/www.analyticalultracentrifugation.com/download.htm SEDFIT] Kroki:

1. Wprowadzić dane.
2. Ustawić położenie menisku i dna kuwety.
3. Wybrać model właściwy dla analizy danych.
4. Wybrać parametry wstępne (najlepiej na podstawie informacji, które dotyczą białka, a są uzyskane innymi metodami, np. dla białka globularnego współczynnik tarcia = 1.2).
5. Wykonać obliczenia.
6. Przyjrzeć się krytycznie wynikom analizy i na tej podstawie dokonać modyfikacji (np. usunąć ostatnie krzywe).
7. Uwzględnić poprawki związane z szumem, udokładnić objętość cząstkową, gęstość i lepkość buforu.
8. Można powtórzyć p. 6 i 7.
9. Zanotować wyniki.

Czym się kierować analizując dane?

1. Zgromadzić dostępną wiedzę na temat obiektu.
2. Wykonać kilka niezależnych eksperymentów (np. dla tych samych stężeń biomolekuł,lub dla różnych znanych stężeń biomolekuł).
3. Wykonać eksperymenty różnymi metodami.
4. Analizować jakość fitu.
5. Dyskutować wyniki z osobami doświadczonymi (jeśli są takie).
6. Kierować się zdrowym rozsądkiem.

Metody ultrawirowania analitycznego znajdują zastosowanie w przemyśle, np. podczas badania jakości i agregacji białek o znaczeniu terapeutycznym.

Różnica pomiędzy białkami a lekami niskocząsteczkowymi jest związana z tym, że aktywność białek stosowanych jako leki silnie zależy od ich konformacji cząsteczkowej.

Analizy za pomocą spektrometrii mas, czy krystalografii nie mówią czy białko jest w odpowiedniej, natywnej konformacji w roztworze, czy dimeryzuje (dimeryzacja może być pożądana lub przeszkadzać).

Ultrawirowanie umożliwia określenie czy białko jest aktywne biologicznie, czy w próbce są obecne agregaty i czy stabilna konformacja makromolekuł jest utrzymywana w zmiennych warunkach pH, temperatury i składu buforu.