Metody Biofizyki Molekularnej/Osmometria

Roztwór to nierozdzielająca się w długich okresach czasu mieszanina dwóch lub więcej związków chemicznych. Skład roztworów określa się przez podanie stężenia składników. W roztworach zwykle jeden ze związków chemicznych jest nazywany rozpuszczalnikiem, a drugi substancją rozpuszczaną.

Osmoza to zjawisko polegające na samorzutnym przechodzeniu cząsteczek rozpuszczalnika przez błonę półprzepuszczalną (np. błonę komórkową), oddzielającą rozpuszczalnik od roztworu. Osmoza zachodzi od roztworu o niższym stężeniu substancji rozpuszczonej do roztworu o wyższym, czyli prowadzi do wyrównania stężeń obu roztworów.

Roztwór, z którego ubywa rozpuszczalnika nazywa się hipotonicznym, tego w którym przybywa nazywa się hipertonicznym. Gdy roztwory pozostają w równowadze osmotycznej, mówi się że są wzajemnie izotoniczne względem siebie.

Ciśnienie osmotyczne

Mechanizm powstawania ciśnienia osmotycznego

Naczynie składa się z dwóch części A i B rozdzielonych błoną. W części naczynia A znajduje się woda, w części naczynia B — woda + związek nieprzechodzący przez błonę. W takiej sytuacji, w części A jest więcej cząsteczek wody i więcej ich zderzeń z błoną niż w części B, a w związku z tym istnieje większe prawdopodobieństwo przejścia cząsteczek wody z części A do B niż odwrotnie. Po pewnym czasie stężenia wody w obydwu komorach zrównoważą się kosztem pojawienia się różnicy objętości cieczy.

Ciśnienie osmotyczne — ciśnienie [math]H\;[/math] jakie należy wywrzeć na naczynie B, aby uniemożliwić zwiększenie jego objętości (ustala się przy nim równowaga dynamiczna, w której jednakowe liczby cząsteczek rozpuszczalnika dyfundują w obydwu kierunkach. Wzrost ciśnienia hydrodynamicznego w roztworze o większym stężeniu jest miarą ciśnienia osmotycznego.

Roztwór hipotoniczny — o niższym ciśnieniu osmotycznym

Roztwór hipertoniczny — o wyższym ciśnieniu osmotycznym

Ciśnienie osmotyczne opisuje zależność:

[math]\pi = \frac{nRT}V = \frac{mRT}{MV}\;[/math]

gdzie: [math]\pi\;[/math] — ciśnienie osmotyczne [kPa], [math]V\;[/math] — objętość [l], [math]R\;[/math] — stała gazowa ([math]\unit{8,31}{ \frac{l\cdot kPa}{K \cdot mol}}\;[/math]), [math]n\;[/math] — liczba moli substancji rozpuszczonej równa [math]\nicefrac mM\;[/math] ([math]m\;[/math] — masa substancji w gramach, [math]M\;[/math] — masa molowa).

1. W stałej temperaturze, w roztworach nieelektrolitów, ciśnienie osmotyczne jest wprost proporcjonalne do stężenia roztworu, nie zależy od rodzaju substancji rozpuszczonej i rozpuszczalnika.
2. Ciśnienie osmotyczne przy stałej objętości roztworu jest wprost proporcjonalne do temperatury, w tych samych temperaturach, roztwory o jednakowych ciśnieniach osmotycznych zawierają jednakowe ilości cząsteczek osmotycznie czynnych (roztwory izoosmotyczne).

Ciśnienie osmotyczne elektrolitów

Dysocjacja elektrolitów na jony powoduje że wykazują one większe ciśnienie osmotyczne niż nieelektrolity o tym samym stężeniu molalnym.

[math]\pi = nfc RT\;[/math]

[math]n\;[/math] — liczba jonów powstałych po dysocjacji cząsteczki elektrolitu, [math]f\;[/math] — współczynnik aktywności jonów (tablica lub obliczenia), dla roztworów rozcieńczonych bliski jedności, [math]c\;[/math] — stężenie molalne

Pojęcie osmola

Roztwory elektrolitów zachowują się tak, jakby zawierały mniej jonów niż to wynika z dysocjacji (stąd możemy obliczyć współczynnik dysocjacji, tu: [math]f= \frac{\pi_3}{\pi_2} = 0,90\;[/math]). NaCl o stężeniu [math]\unit{0,01}{\frac{ mol}{kg}}\;[/math] odpowiada ciśnienie osmotyczne [math]\pi=2\cdot 0,9 \cdot 0,01\cdot RT=\unit{0,018}{ [kPa]}\;[/math] (zamiast 0,02).

Osmol — ilość substancji, która rozpuszczona w 1 litrze (kg) wody wywiera ciśnienie [math]\unit{2,27}{ MPa}\;[/math]. Roztwór NaCl o stężeniu [math]\unit{0,01}{\frac{mol}{kg}}\;[/math] jest 0,018-osmolalny.

Dla roztworów rozcieńczonych stężenie jonów odpowiada stężeniu w osmolach ([math]f \cdot n\;[/math] we wzorze pomijamy gdy stężenie jest wyrażone w osmolach).

Osmometria w zastosowaniach biofizycznych

Cząsteczki małocząsteczkowe, biopolimery, polimery naturalne

• Ściśle określona budowa chemiczna.
• Każda metoda mierząca ciężar cząsteczkowy daje ten sam wynik.
• Pojęcie ciężaru cząsteczkowego jest jednoznaczne.

Polimery syntetyczne

• Mieszaniny makrocząsteczek o różnych wymiarach .
• Każda metoda pomiarowa daje inny wynik zależny od metody, wynik jest wartością średnią.

Co to za średnia?

Masy cząsteczkowe mieszanin cząsteczek o różnych masach molowych, otrzymuje się jako wartości średnie, których natura zależy od metody oznaczania.

Ilościowo (liczbowo) średnia masa cząsteczkowa

[math]\bar{M} = \frac{\sum_i M_iN_i}{\sum_i N_i} = \frac 1 N \sum_i M_i \cdot N_i\;[/math]

[math]N_i\;[/math] — liczba cząsteczek, [math]M_i\;[/math] — masa cząstki i [math]N\;[/math] — całkowita liczba wszystkich cząsteczek w próbce.

Wagowo (masowo) średnia masa cząsteczkowa

[math]\bar{M}_W = \frac 1 m\sum_i M_im_i = \frac{\sum_i M^2_i \cdot N_i}{\sum_i M_i \cdot N_i}\;[/math]

[math]N_i\;[/math] — liczba cząsteczek, [math]M_i\;[/math] — masa cząstki [math]i\;[/math], [math]m_i\;[/math] — łączna masa cząsteczek o masie cząsteczkowej [math]M_i\;[/math], [math]m\;[/math] — masa całej próbki.

Jeszcze o średnich

Ilościowo średnia masa cząsteczkowa "preferuje" cząsteczki o mniejszej masie, ale częściej występujące w mieszaninie, zaś wagowo średnia masa cząsteczkowa "preferuje" cząsteczki o większej masie.

Pierwsza jest zawsze mniejsza od drugiej.

[math]\bar M \lt \bar M_W\;[/math]

Pomiary wagowo średniej masy cząsteczkowej odbywają się metodami opartymi na rozpraszaniu światła, szybkości sedymentacji, równowadze sedymentacyjnej. Są to techniki, w których na wynik ma wpływ rozmiar cząsteczek.

Pomiary ilościowo średniej masy cząsteczkowej to pomiary metodami ebuliometryczną (masy<5·104), kriometryczną (masy < 2·10⁴), osmometryczną (masy 5·10³ - 10⁶). Są to techniki, w których na wynik ma wpływ liczba cząstek (techniki oparte na właściwościach fizycznych roztworów wykazujących zależność od stężenia molowego związku rozpuszczonego).

Osmometria

Osmometria jest najczęściej stosowaną techniką, ale na wyniki może mieć wpływ dobór rozpuszczalnika, temperatury i stężenia roztworów oraz niedokładne usunięcie roztworów stosowanych w procesach rozdziałów (np. niewielka ilość niskocząsteczkowej substancji, np. soli, zwiększa udział w roztworze cząsteczek czynnych osmotycznie.

Potencjał chemiczny

Potencjał chemiczny — pochodna cząstkowa energii wewnętrznej po liczbie cząstek, przy stałej objętości i entropii układu:

[math]\mu_i = \frac{\partial U}{\partial N_i}_{S,V,N_{j\neq i}}\;[/math].

Rozpuszczenie substancji powoduje obniżenie potencjału chemicznego rozpuszczalnika. Efekty:

• podwyższenie temperatury wrzenia,
• obniżenie temperatury krzepnięcia,
• wzrost ciśnienia osmotycznego mieszaniny.

Dla roztworów rozcieńczonych efekty te zależą od ilości molekuł substancji rozpuszczonej.

Prężność par

W zamkniętym naczyniu, napełnionym częściowo cieczą ustala się równowaga pomiędzy cząsteczkami substancji w stanie ciekłym i gazowym. Równowaga ma charakter dynamiczny. Ilość cząsteczek biorących udział w tym procesie rośnie wraz z temperaturą i determinuje ciśnienie par gazu nad cieczą.

Ciśnienie gazu nad cieczą w danej temperaturze nosi nazwę prężności pary. Równowagowe ciśnienie par gazu nad cieczą warunkach gdy szybkość parowania jest równoważna szybkości skraplania nazywamy prężnością pary nasyconej.

Stosunek prężności par opisuje prawo Raoulta:

Stosunek prężności pary każdego składnika mieszaniny do jego prężności pary w czystej cieczy jest w przybliżeniu równy ułamkowi molowemu tego składnika w roztworze.

[math]\frac{p_i}{p^0_i} = x_i\;[/math]

Gdzie: [math]p_i\;[/math] — prężność par dla składnika mieszaniny (np. rozpuszczalnika), [math]p_i^0\;[/math] — prężność par dla składnika mieszaniny w postaci czystej cieczy, [math]x_i\;[/math] — ułamek molowy składnika mieszaniny w roztworze.

Roztwory idealne spełniają to prawo Raoulta w całym zakresie stężeń.

Im większe stężenie składnika tym lepiej spełnione jest prawo Raoulta — dobre przybliżenie dla rozpuszczalników substancji rozcieńczonych.

Prężność pary nad roztworem jest liniową funkcją składu. Względne obniżenie prężności pary rozpuszczalnika nad roztworem jest równe ułamkowi molowemu substancji rozpuszczonej.

Skutek: podwyższenie temperatury wrzenia i obniżenie temperatury krzepnięcia roztworu w stosunku do czystego rozpuszczalnika jest zależne od ułamka molowego substancji rozpuszczonej i właściwości rozpuszczalnika.

Ebuliometria — opiera się na zjawisku podwyższenia temperatury wrzenia roztworu w porównaniu z temperaturą wrzenia czystego rozpuszczalnika.

Kriometria &mdash: obniżenie temperatury topnienia roztworu w porównaniu z temperaturą topnienia czystego rozpuszczalnika.

Dla roztworów rozcieńczonych [math]x_i \sim c\;[/math] (stężenie molalne) mamy następujące zależności:

[math]\Delta p = K_p c\;[/math]

[math]\Delta T_e = K_e c\;[/math]

[math]\Delta T_k = K_k c\;[/math]

gdzie [math]K_p\;[/math] — molalne obniżenie prężności pary, [math]K_w\;[/math] — molalne podwyższenie temperatury wrzenia (stała ebulioskopowa), [math]K_k\;[/math] — molalne obniżenie temperatury krzepnięcia (stała krioskopowa), (wartości liczbowe współczynników — stałych molalnych rozpuszczalnika — odpowiadają zmianom spowodowanym rozpuszczeniem jednego mola substancji w 1000 g rozpuszczalnika, są wyznaczone eksperymentalnie i zebrane w tablicach).

Wyznaczenie [math]\Delta T_w\;[/math] lub [math]\Delta T_k\;[/math] umożliwia obliczenie masy cząsteczkowej.

Metoda kriometryczna — precyzyjny pomiar temperatury krzepnięcia czystego rozpuszczalnika i roztworu badanej substancji.

Metoda ebuliometryczna

Umożliwia precyzyjny pomiar temperatury wrzenia czystego rozpuszczalnika i roztworu badanej substancji.

[math]K_e = \frac{RT_1^2M_1}{\Delta H_e}\;[/math]

gdzie [math]R\;[/math] — stała gazowa, [math]T_1\;[/math] — temperatura wrzenia lub krzepnięcia czystego rozpuszczalnika, [math]M_1\;[/math] — masa cząsteczkowa rozpuszczalnika, [math]\Delta H_e,\ \Delta H_k\;[/math] — molowe ciepło parowania lub topnienia rozpuszczalnika.

Prawo van’t Hoffa (dla roztworów idealnych, bardzo rozcieńczonych)

[math]\pi = cRT\;\;[/math]

gdzie: [math]\pi\;[/math] — ciśnienie osmotyczne, [math]c\;[/math] — stężenie molowe substancji rozpuszczonej.

Pomiar ciśnienia osmotycznego — można badać cząsteczki o dużych masach, metoda bardzo czuła.

Dla roztworów nieidealnych, wielkocząsteczkowych przyjmuje się, że równanie van’t Hoffa jest pierwszym członem rozwinięcia:

[math]\pi = cRT(1+B_1c +\ldots)\;\;[/math]

gdzie [math]B\;[/math] — osmotyczny współczynnik wirialny (człony dodatkowe są związane z odstępstwem od roztworu idealnego).

Obliczanie mas cząsteczkowych substancji rozpuszczonych

Do pomiarów mas cząsteczkowych substancji rozpuszczonych wykorzystuje się osmometry.

W przypadku osmometrów bezmembranowych obniżenie prężności par rozpuszczalnika nastepuje po wprowadzeniu na końcówkę jednego z termistorów (półprzewodnikowe sondy temperaturowe) w atmosferze pary rozpuszczalnika roztworu substancji badanej. Na końcówce drugiego termistora znajduje się kropla z rozpuszczalnikiem.

Szybkość kondensacji par na kropli roztworu jest większa niż na kropli rozpuszczalnika (niższa prężność pary), wydziela się więcej ciepła i szybciej rośnie temperatura — między termistorami powstaje różnica temperatur proporcjonalna do stężenia substancji rozpuszczonej.

Dla roztworów idealnych:

[math]\Delta t =c\frac KM\;[/math]

Dla mieszanin rzeczywistych:

[math]\frac{\Delta t}{c} = \frac KM(1+\Gamma_2c+\Gamma_3c^2+\ldots)\;[/math]

gdzie: [math]K\;[/math] — stała dla rozpuszczalnika, [math]M\;[/math] — średnia masa cząsteczkowa substancji rozpuszczonej, [math]\Gamma_i\;[/math] — współczynniki zależne od rodzaju substancji rozpuszczonej i właściwości roztworu (jeśli [math]\Gamma_3 = 0\;[/math] to zależność jest linią prostą o odciętej [math]\nicefrac KM\;[/math]).

Należy wykonać pomiary różnicy temperatur [math]\Delta t\;[/math] dla kilku stężeń roztworów [math]c\;[/math] obejmujących również bardzo niskie stężenia. Ekstrapolacja do stężenia zerowego pozwala policzyć [math]\frac KM\;[/math].

Pomiary wymagają kalibracji aparatu przy użyciu substancji o znanej masie cząsteczkowej, co pozwala wyznaczyć [math]a=\frac{K_\mathrm{KAL}}{M_\mathrm{ZNANE}}\;[/math] i dalej [math]K_\mathrm{KAL}\;[/math]. Dla substancji badanej z wykresu [math]\frac{\Delta t}{c} = f(c)\;[/math] odczytujemy wartość [math]\left(b=\frac{K_\mathrm{POM}}{M_\mathrm{POM}}\right)\;[/math] i obliczamy liczbowo średnią masę cząsteczkową [math]M\;[/math], wiedząc, że [math]K_\mathrm{KA}L=K_\mathrm{POM}\;[/math], z zależności:

[math] aM_\mathrm{ZNANE}=bM_\mathrm{POM}\;\;[/math]

[math]M_\mathrm{POM} = \unit {\frac{K_\mathrm{KAL}}b} {\left[\frac g{mol}\right]}\;[/math]

Często roztwory muszą być dobrze rozcieńczone, aby móc wykonać prawidłową ekstrapolację do rozcieńczenia nieskończonego.

Opisane metody osmometryczne są obecnie stosowane częściej w pracowniach przemysłowych niż w laboratoriach biofizycznych.

Zastosowanie osmometrii w medycynie

Osmometr umożliwia szybkie i dokładne oznaczenie osmolalności mikropróbek o objętości 100 µl.

Surowica krwi

• Ocena zawartości wody w osoczu.
• Możliwość szybkiego stwierdzenia występowania substancji o niskim ciężarze cząsteczkowym: etanol, metanol, paraldehyd, aceton, glikol etylenowy oraz leków

Funkcjonowanie nerek

• Wskaźnik [math]\nicefrac{\mathrm{Osm}_\mathrm{moczu}}{\mathrm{Osm}_\mathrm{osocza}}\;[/math] umożliwia ocenę funkcji wydzielniczej nerek — ich zdolności koncentracji moczu.
• Jest to podstawowy pomiar w ocenie funkcji nerek u osób w stanie krytycznym, po zatruciach lub urazach wielonarządowych.

Przykład

[math]\nicefrac{\mathrm{Osm}_\mathrm{moczu}}{\mathrm{Osm}_\mathrm{osocza}}\;[/math]	Schorzenie
0.2 – 0.7	Moczówka prosta
< 3.0	Niewydolność śródmiąższowa
3.0 – 4.7	Zdrowy osobnik na diecie z ograniczeniem płynów
1.0 – 3.0	Zdrowy osobnik na normalnej diecie