Metody Biofizyki Molekularnej/Spektrometria mas

Wstęp

Spektrometria masowa (ang. Mass Spectrometry, MS) to technika analityczna pozwalająca na dokładny pomiar stosunku masy do ładunku elektrycznego jonu, co, przy znanym ładunku jonu pozwala obliczyć masę z dokładnością do pojedynczych atomów.

Do lat 70-tych XX w. masy białek szacowano metodami takimi jak: elektroforeza, chromatografia, ultrawirowanie. Jednak wyniki uzyskiwane tymi metodami były nieprecyzyjne, a błąd wynosił 10 - 100%. Wprowadzenie techniki MS umożliwiło znaczny postęp w tej dziedzinie. Dzięki MS w przypadku małych układów można dokonać pomiaru masy z dokładnością do 0.0001 u, na przykład możliwe jest rozróżnienie związków C5H12 o masie M = 72.0939 u oraz C4H8O o masie M = 72.0575 u.

Technika MS początkowa ograniczona była do zjonizowanych substancji lotnych, ale rozwój metod jonizacji umożliwił dokładne określanie mas w szerokim zakresie, również dla substancji będących wyjściowo w stanie stałym i ciekłym.

Spektrometria masowa znajduje zastosowania w badaniach:

1. Masy cząsteczkowej.
2. Składu chemicznego.
3. Budowy strukturalnej cząsteczek.
4. Czystości substancji.
5. Identyfikacji zanieczyszczeń.

Zalety spektrometrii masowej:

1. Dokładność wyznaczenia masy.
2. Zakres zastosowania: od peptydów do dużych białek (>200 kDa). MS umożliwia detekcję strukturalnych wariantów białek (mutanty, białka zmodyfikowane posttranslacyjnie).
3. Rozdzielczość: kilka jednostek masy atomowej.

Początki rozwoju spektrometrii masowej sięgają końca XIX wieku, kiedy to po odkryciu promieni katodowych Thompson dokonał pierwszego pomiaru stosunku masa/ładunek dla elektronu w 1896 roku z zależności:

[math]\frac{q_0}m = \frac{2yE}{B^2 l^2}[/math],

gdzie: E — wartość przyłożonego pola elektrycznego, B — wartość przyłożonego pola magnetycznego prostopadłego do E, l — długość płytek odchylających, y — przesunięcie plamki na ekranie.

Podstawy fizyczne MS

Jonizacja cząsteczek umożliwia przyspieszenie ich w polu elektrycznym w próżni. Energia kinetyczna przyspieszanego jonu jest opisana równaniem:

[math]E_\mathrm{kin} = zV_\mathrm{acc}=\frac{mv^2}{2}[/math].

Wiązka przyspieszonych jonów wpada w jednorodne pole magnetyczne o wektorze indukcji B i ulega odchyleniu. Zakładając równość siły dośrodkowej i siły Lorentza otrzymujemy:

[math]F= zvB=\frac{mv^2}{r}[/math],

gdzie: m — masa jonów, z — ładunek jonów, B — wektor indukcji magnetycznej, v — prędkość jonu, r — promień krzywizny toru w polu magnetycznym, [math]V_\mathrm{acc}[/math] — różnica potencjałów. Korzystając z powyższych równań otrzymujemy:

[math]\frac mz = \frac{2V_\mathrm{acc}}{v^2}=\frac{2V_\mathrm{acc}m^2}{z^2B^2r^2}[/math].

I dalej:

[math]\frac mz = \frac{B^2r^2}{2V_\mathrm{acc}}[/math]

Wniosek:

Za pomocą pola magnetycznego, działającego na monoenergetyczną wiązkę jonów, można wyznaczać stosunki m/z, a przy znanym ładunku jonów wprost ich masy. Heterogeniczny strumień jonów można rozdzielić na składowe, zależnie od stosunku masy do ładunku [math](\nicefrac mz)[/math].

Podstawowym warunkiem zastosowania spektrometrii mas jest posiadanie przez badane cząsteczki ładunku. Cząsteczka musi być jonem! Jeśli próbka zawiera cząsteczki obojętne należy nadać im ładunek poprzez jonizację. W przypadku jonizacji polegającej na protonacji lub deprotonacji masa mierzona w spektrometrze będzie powiększona lub pomniejszona o masę protonu lub protonów przyłączonych lub odłączanych od cząsteczki analizowanej substancji. Jonizacja elektronami powoduje jedynie wybicie elektronu bez przyłączania protonu.

Podstawowe pojęcia spektrometrii mas

Rozdzielczość

Rozdzielczość jest zdefiniowana jako [math]R = \frac M{\Delta M}[/math], gdzie [math]\Delta M\;[/math] jest określona dla sąsiadujących, rozróżnialnych mas [math]M\;[/math] i [math]M+\Delta M\;[/math]. Rozdzielczość 100 000 umożliwia np. rozdzielenie mas równych 100 000 Da i 100 001 Da. Stosuje się dwa kryteria rozdzielczości:

1. „10%-owa dolina” — jeśli dwa sąsiednie piki przekrywają się na poziomie 10 % wysokości jest to szerokość piku mierzona na poziomie 5% wysokości,
2. „pełna szerokość w połowie maksimum”, FWHM – full width, half-maximum - szerokość połówkowa.

Rozdzielczość piku = masa piku [Da] podzielona przez odległość między punktami odpowiadającymi połowie maksymalnej wartości piku [Da].

Zgodnie z zastosowanym kryterium:

[math]R_\mathrm{FWHM}=\frac M{\Delta M_{50\%}}[/math].

Dokładność wyznaczenia masy cząsteczkowej

Dokładność wyznaczenia masy cząsteczkowej jest zdefiniowana jako różnica pomiędzy zmierzoną i obliczoną masą dla danego jonu. Jest ona podawana w % zmierzonej masy (10 000 ± 0.01%) lub w ppm (10 000 ± 100 ppm).

Masa monoizotopowa

Węgiel występuje w przyrodzie w postaci izotopów: ¹²C — 98.8%, ¹³C — 1.1 %.

Podobnie azot: ¹⁴N — 99.6 %, ¹⁵N — 0.4 %

Monoizotopowe piki uzyskuje się dla cząsteczek, w których występuje jeden izotop pierwiastka. W rzeczywistości cząsteczki jednego związku mogą mieć masy różniące się ze względu na obecność w cząsteczce różnych izotopów np. n-butan, C₄H₁₀ – 4%-owe prawdopodobieństwo występowania w cząsteczce izotopu ¹³C (prawdopodobieństwo występowania cząsteczek zawierających 2 lub 3 takie atomy jest zaniedbywalne).

Dla cząsteczek biologicznych zawierających setki atomów węgla i azotu widmo masowe staje się bardzo skomplikowane. Jego rozkład można przewidzieć teoretycznie. Chemiczna średnia masa cząsteczki jest średnią mas zawierających wszystkie stabilne izotopy.

Jonizacja cząsteczek

Jony tworzą się pod wpływem bombardowania substancji elektronami, atomami, jonami. Utworzony jon rozpada się następnie na pewną liczbę mniejszych jonów, o charakterystycznych masach pozwalających na ich identyfikację.

Wyróżniamy następujące typy jonów:

• Jon molekularny — jon o masie równej masie cząsteczkowej związku z dokładnością do masy elektronu.
• Jon pseudomolekularny — jon powstający po dołączeniu do cząsteczki jonów H⁺, Na⁺, Cl⁺ lub lub odłączeniu jonu H⁺.
• Jony fragmentacyjne — pod wpływem jonizacji cząsteczka może ulec rozbiciu na pewną liczbę jonów o charakterystycznych masach.

W typowym widmie MS widzimy jony związane z różną masą izotopową cząsteczek, jony molekularne, jony pseudomolekularne oraz jony fragmentacyjne.

Nawet niewielka cząsteczka może mieć skomplikowane widmo masowe, zależne dodatkowo od sposobu jonizacji.

Układy wprowadzania próbki

Poszczególne układy różnią się zależnie od stanu skupienia analizowanej próbki i metody jonizacji:

• stan stały – sondy z probówką, płytki (jonizacja typu EI, MALDI),
• stan ciekły – zawory wstrzykowe, pompy strzykawkowe, systemy HPLC, FPLC, systemy elektroforezy kapilarnej (jonizacja typu ESI, MALDI),
• stan gazowy – układy chromatografii GC, komory próżniowe, systemy strzykawek gazoszczelnych (jonizacja typu EI, CI, ICP).

Metody jonizacji próbki

Jonizacja strumieniem elektronów (EI — electron ionization)

Po przyłożeniu napięcia katoda emituje elektrony o ściśle określonej energii, które zderzając się z cząsteczkami próbki wybijają elektron lub elektrony z ich orbit walencyjnych. Konieczne jest przeprowadzenie badanej substancji w stan pary. Jonizacja odbywa się w próżni. Metoda ta powoduje zwykle fragmentację badanych cząsteczek. EI charakteryzuje się stosunkowo małą wydajnością — poniżej 1% cząsteczek ulega jonizacji.

Postać wyników: piki jonów molekularnych obserwowane w widmie masowym posiadają zazwyczaj ładunek +1. W przypadku niskorozdzielczej analizy typu EI masa cząsteczkowa próbki jest zazwyczaj równa [math]\nicefrac mz[/math].

Najczęściej stosowany zakres analizy to 10-1000 Da — cząsteczki o wyższych masach ulegają łatwo dekompozycji przy stosowaniu jonizacji typu EI.

Najczęściej analizowane próbki: niskocząsteczkowe, nieorganiczne, organiczne w postaci stałej.

Zastosowania: potwierdzanie masy cząsteczkowej substancji po syntezie, analiza niskocząsteczkowych zanieczyszczeń, nadzór prawidłowości procesów technologicznych.

Jonizacja chemiczna (CI — Chemical Ionization)

Konieczność przeprowadzenia związku w stan pary (podobnie jak dla EI) — ograniczona możliwość analizy cząsteczek takich jak: peptydy, cukry, białka.

W wyniku jonizacji wiązką elektronów gazu buforowego (najczęściej jest nim metan) pod ciśnieniem 10^-4 mm Hg powstają jony molekularne CH₅⁺, które następnie jonizują cząsteczki analizowanej substancji. Gaz buforowy jest obecny w dużym nadmiarze (~ 100 razy) w stosunku do analizowanej substancji. Jest to stosunkowo delikatny sposób jonizacji, pozwala na zmniejszenie stopnia fragmentacji cząsteczki, produkuje jony MH⁺. Jony te ulegają w małym stopniu dalszemu rozpadowi, gdyż nie mają one dużego nadmiaru energii wewnętrznej. Z tego powodu jony MH⁺ są jonami o dużej intensywności, często o największej.

Jonizacja laserem wspomagana matrycą (MALDI — Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)

Analizowana substancja jest rozpuszczana w lotnym rozpuszczalniku, a następnie mieszana z roztworem matrycy (roztwór cząstek organicznych absorbujących promieniowanie laserowe). Mieszaninę nanosi się na płytkę ze stali nierdzewnej i pozwala odparować rozpuszczalnikowi w strumieniu powietrza. Po wysuszeniu próbkę wprowadza się do komory pomiarowej i usuwa powietrze. Następnie próbkę naświetla się impulsami lasera, co powoduje wzbudzenie matrycy.

Matrycami stosowanymi w technice MALDI są substancje, które:

• Dobrze absorbują promieniowanie z zakresu UV.
• Łatwo sublimują.
• Po desorpcji dostarczają dużych ilości jonów (protonów) potrzebnych do jonizacji badanej substancji.

Skoncentrowany impuls laserowy trwający ok. 3 ns oddziałujący z matrycą wywołuje ciąg następujących po sobie reakcji:

• Absorpcja promieniowania przez materiał matrycy.
• Odparowanie próbki i wyrzucenie strumienia gazów.
• Dysocjacja termiczna matrycy.
• Tworzenie jonów.
• Reakcje jonów z badaną substancją i jej jonizacja.

Przyjmuje się, że możliwe są następujące drogi jonizacji próbki:

• Dysocjacja termiczna z utworzeniem pary kation–anion.
• Oderwanie elektronu.
• Oderwanie bądź przyłączenie protonu.
• Przyłączenie kationu bądź anionu.

Wytworzone jony są przyspieszane w polu elektrycznym i kierowane do detektora.

Technika MALDI jest zaliczana do łagodnych sposobów jonizacji, pokrewnych jonizacji chemicznej. Główną część energii cieplnej, przekształcanej następnie w energię drgań wiązań chemicznych, pochłania matryca, co chroni badaną substancję przed rozkładem.

Stwierdzono:

• Bardzo krótkie (3 ns) impulsy promieniowania o dużej koncentracji energii aplikowane próbkom znajdującym się w wysokiej próżni (10^-6 – 10^-8 Torr) powodują raczej odparowanie materiału, aniżeli jego rozkład, nawet w przypadku materiałów tak wrażliwych, jak białka o masie cząsteczkowej > 100 000 Da.
• Substancje o małej masie cząsteczkowej [math](M \lt \unit{1 000}{Da})[/math] często ulegają w tych warunkach fragmentacji (duże cząsteczki mają wiele stopni swobody — zaabsorbowana energia ulega rozproszeniu bez rozerwania wiązań chemicznych).

Metoda ta jest stosowana głównie do sekwencjonowania peptydów i określania masy cząsteczkowej białek. Zakres analizy to 500 - 1000000 Da. Najczęściej analizowane są średnio- i wysokocząsteczkowe substancje organiczne, peptydy, białka, polimery, kwasy nukleinowe. Metoda znajduje zastosowanie w biochemii, biotechnologii, farmakologii, neurochemii, immunologii.

Postać wyników: najczęściej jonizacja +1, rzadziej +2, możliwość obserwacji niekowalencyjnych kompleksów. W widmie pojawiają się jony pojedynczo (M⁺) i wielokrotnie (M²⁺, M³⁺) zjonizowane oraz jony agregatów polimeru o różnym stopniu zjonizowania 2M⁺, 3M²⁺, 2M³⁺.

Zalety metody:

• wysoka czułość, możliwość analizy pikomolowych ilości białka,
• delikatna jonizacja, umożliwiająca małą fragmentację,
• tolerancja dla soli w stężeniu milimolowym.

Wady metody:

• stosowanie matryc może stanowić problem w pomiarach dla związków o masie poniżej 700Da,
• możliwość fotodegradacji na skutek desorpcji/jonizacji laserem,
• stosowanie kwaśnych matryc może powodować rozpad niektórych badanych substancji

Jonizacja przez rozpylanie w polu elektrycznym (ESI — electrospray ionization)

Pierwszym etapem jest jonizacja próbki w stanie ciekłym pod ciśnieniem atmosferycznym w silnym polu elektrycznym (napięcia rzędu 2000-5000 V). Na powierzchni cieczy opuszczającej kapilarę akumulują się ładunki. Następnie strumień cieczy ulega rozbiciu na naładowane kropelki.

Kolejnym etapem jest odparowanie rozpuszczalnika. Powoduje to kurczenie kropelek do momentu, gdy odpychanie elektrostatyczne przewyższy siły spójności cieczy, co rozrywa kropelki i powoduje powstanie jonów często o ładunku wielokrotnym.

Najczęściej analizowane próbki: średnio- i wysokocząsteczowe substancje organiczne, peptydy, białka, polimery, kwasy nukleinowe w postaci ciekłej o zakresie mas 50 – 80000 Da. Metodę jonizacji ESI stosuje się w biochemii, biotechnologii, farmakologii, neurochemii, medycynie sądowej, oraz w detekcji w chromatografii cieczowej.

Postać wyników: serie pików odpowiadających kolejnym, wielokrotnie naładowanym, protonowanym jonom [M+zH]^z+, [M+(z+1)H]^(z+1)+, itd.

Zalety metody:

• uniwersalna metoda, umożliwiająca przeprowadzenie substancji z roztworu w formę zjonizowanego gazu,
• minimalna fragmentacja próbki podczas jonizacji,
• wysoka czułość,
• kompatybilność z technikami chromatograficznymi (LC) oraz elektroforetycznymi,
• możliwość analizy dużych cząsteczek,
• możliwość badania substancji rozpuszczonych w różnych rozpuszczalnikach.

Wady metody:

• obecność soli i mieszanin może obniżać czułość,
• wymagana duża czystość próbki.

Jonizacja wysokoenergetycznymi atomami (FAB — fast atom bombardment)

Metoda FAB jest stosowana w przypadku jonów zawartych w nielotnych rozpuszczalnikach, takich jak gliceryna, alkohol m-nitrobenzymowy. Nie można jej stosować do substancji niepolarnych.

Wiązka szybkich atomów (argonu, ksenonu) uzyskiwana jest z wykorzystaniem jonów (np. cezu). Przyspieszane jony trafiają do komory zderzeniowej, gdzie przekazują atomom pęd. Obojętne atomy uderzają w roztwór analizowanej substancji wyrzucając z roztworu jony i cząsteczki obojętne. Wyrzucane jony są kierowane do analizatora. Metodę można stosować do mieszanin o maksymalnej masie 10 kDa.

Postać wyników: widmie obserwuje się jony [M+H]ⁿ⁺ lub [M+H]^n-. Zalety metody:

• szybkość i łatwość wykonania,
• łatwe do interpretacji widma,
• możliwość prostego regenerowania źródła atomów/jonów.

Wady metody:

• średnia czułość metody,
• problemy z analizą mieszanin,
• możliwość wpływu matrycy na jakość widma.

Inne metody jonizacji próbki

1. Jonizacja polem (field ionisation, FI).
2. Termorozpylanie (termospray, TE) .
3. Desorpcja polem (field desorption, FD).
4. Desorpcja laserowa (laser desorption, LD).
5. Plazma wzbudzona indukcyjnie (ICP).

Należy pamiętać, że w wyniku jonizacji cząsteczek jednego rodzaju różnymi metodami otrzymuje się różne widma masowe.

Techniki jonizacyjne stosowane w przypadku biomolekuł zamieszczono w poniższej tabeli:

Biomolekuły	Metoda jonizacji	Mechanizm jonizacji
Peptydy	FAB, MALDI, ESI	protonacja, deprotonacja
Białka	MALDI, ESI	protonacja
Węglowodory	FAB, MALDI, ESI	protonacja, deprotonacja, kationozacja (inny kation niż H+)
Oligonukleotydy	MALDI, ESI	protonacja, deprotonacja, kationozacja
Małe biomolekuły	FAB, MALDI, ESI	protonacja, deprotonacja, kationozacja, wybicie elektronu

Próbki białek do badań zwykle wykonuje się w objętości 5 – 50 μl i stężeniu 10 – 100 μM.

Analizatory masy

Analizator czasu przelotu (Time Of Flight TOF)

Powstałe jony są wprowadzane do analizatora, gdzie pod wpływem impulsu elektrycznego ulegają przyspieszeniu i zaczynają przemieszczać się w kierunku detektora jonów połączonego z urządzeniem rejestrującym czas od impulsu przyspieszającego do momentu uderzenia określonego jonu w detektor. Czas przelotu jest przeliczany na stosunek [math]\nicefrac mz[/math]. Ze wzrostem [math]\nicefrac mz[/math] jony poruszają się coraz wolniej.

Rozdzielczość analizatora początkowo wynosiła < 1000. Obecnie stosuje się analizatory ze zwierciadłem elektrostatycznym, które zwiększa rozdzielczość aparatu do kilkudziesięciu tysięcy, ale zmniejsza zakres dopuszczalnych mas cząsteczkowych. Analizatory TOF są najczęściej stosowane razem ze źródłami jonów MALDI.

Tandemowa spektrometria masowa (MS/MS)

Podstawowy układ składa się z dwóch spektrometrów masowych. Za pomocą pierwszego spektrometru selekcjonuje się wybrany jon (najczęściej jon molekularny) na podstawie stosunku [math]\nicefrac mz[/math]. Jon ten (macierzysty, parent ion) poddawany jest zderzeniom np. z wprowadzonym gazem obojętnym. Na skutek zderzeń jon macierzysty rozpada się na jony fragmentacyjne (daughter ions), które można analizować za pomocą drugiego spektrometru. Układy stosowane w tandemowej spektrometrii mas mogą składać się z szeregu spektrometrów, MS_n (gdzie [math]n = 2,3 \ldots[/math]), co wydatnie zwiększa możliwość identyfikacji próbek.

Sektor magnetyczny i elektryczny

Sektor magnetyczny umożliwia pomiary zmiany toru lotu jonów w polu magnetycznym. Stopień zakrzywienia toru zależy od stosunku masy do ładunku ([math]\nicefrac mz[/math]), prędkości jonu i od parametrów pola magnetycznego. Sektor magnetyczny charakteryzuje się niską rozdzielczością (< 5000) związaną z dużymi różnicami prędkości cząsteczek wpadających do urządzenia. Problem rozdzielczości rozwiązuje przez zastosowanie sektora elektrycznego przed sektorem magnetycznym, w którym cząsteczki są rozpędzane, dzięki czemu różnice prędkości są mniejsze.

Sektor elektryczny jest zbudowany z dwóch równoległych, zakrzywionych płyt do których przyłożono potencjał elektryczny umożliwiający przyspieszanie jonów. Jony o jednakowej prędkości mają jednakowe tory lotu w sektorze elektrycznym. Za sektorem elektrycznym znajduje się szczelina przez którą przelatują tylko jony o określonej energii trafiające następnie do sektora magnetycznego.

Kwadrupol i pułapka jonowa

Kwadrupol — zbudowany z czterech symetrycznie ułożonych równoległych prętów. Działa jako filtr masy – w jednym momencie przepuszcza tylko jony o określonym stosunku masy do ładunku ([math]\nicefrac mz[/math]). Dzieje się to dzięki przykładaniu do prętów prądu zmiennego o określonej częstotliwości i napięciu oraz napięcia stałego. Kwadrupol można ustawić tak, aby przepuszczał jony o szerokim lub wąskim zakresie [math]\nicefrac mz[/math].

Pułapka jonowa (Ion trap — IT) jest analizatorem pozwalającym na przetrzymywanie jonów. Działa na zasadzie podobnej do kwadrupola. Manipulując parametrami prądu przyłączonego do elektrod można uwięzić w pułapce jony o określonym stosunku masy do ładunku ([math]\nicefrac mz[/math]) lub jony o szerokim zakresie [math]\nicefrac mz[/math]. Pomiaru masy dokonuje się przez uwięzienie w pułapce jonów o szerokim zakresie [math]\nicefrac mz[/math] i wyrzucanie z pułapki kolejnych grup jonów o określonym [math]\nicefrac mz[/math]. Pułapki jonowe charakteryzują się zwykle dość niewielką rozdzielczością (kilku tysięcy) oraz bardzo dużą czułością.

Analizator cyklotronowego rezonansu jonów i analizator cyklotronowego rezonansu jonów z fourierowską transformacją wyników

Analizator cyklotronowego rezonansu jonów (Ion Cyclotron Resonance ICR) W tym typie analizotora jony są pułapkowane w cyklotronie, gdzie wpadają w ruch kołowy. Widmo [math]\nicefrac mz[/math] jest tworzone przez działanie na jony polem elektromagnetycznym o zmieniającej się częstotliwości i rejestrację zmian natężenia prądu w płytach detektorowych lub zmiany absorpcji fali elektromagnetycznej. W analizatorze panuje bardzo wysoka próżnia — ciśnienie nie większe niż 10^-4 Pa, zwykle 10^-6 Pa lub mniejsze. Rozdzielczości analizatorów cyklotronowych mogą być bardzo duże, zwykle kilkaset tysięcy, mogą dochodzić nawet do miliona (przy [math]\nicefrac mz = \unit{500}{Th}[/math]), ale zmniejszają się wraz ze wzrostem [math]\nicefrac mz[/math] analizowanej cząsteczki.

Analizator cyklotronowego rezonansu jonów z fourierowską transformacją wyników (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance FT-ICR) działa podobnie jak analizator cyklotronowego rezonansu jonowego. W analizatorze FT-ICR zastosowano bardziej wydajną metodę zbierania danych niż w ICR. Przy pomocy złożonej fali elektromagnetycznej wzbudzane są jednocześnie wszystkie jony. Na płytach detektora rejestrowany jest sygnał zawierający wiele częstotliwości charakterystycznych dla jonów o różnym [math]\nicefrac mz[/math], który nastepnie jest przekształcany w widmo [math]\nicefrac mz[/math] przy pomocy transformacji Fouriera. Analizatory FT-ICR są znacznie szybsze niż analizatory ICR, inne parametry (rozdzielczość, czułość itp.) są podobne. Analizatory FT-ICR wyparły obecnie z rynku analizatory ICR.

Detektory

Zadaniem detektorów jest rejestracja jonów przechodzących przez analizator.

1. Puszka Faradaya to metalowa, cylindryczna komora z otworem przez który wlatują jony. Gdy jony docierają do dna puszki oddają jej swój ładunek, co powoduje przepływ niewielkiego prądu podlegającego rejestracji. Detektory te charakteryzują się małą czułością.
2. Powielacz elektronowy jest to detektor zbudowany z serii płytek, do których przyłączono wysokie napięcie. Jony po uderzeniu w pierwszą płytkę (dynodę konwersyjną), powodują emisję elektronów, które z kolei uderzają w następną płytkę (dynodę) powodując wybicie większej liczby elektronów. W ten sposób sygnał jest kaskadowo wzmacniany i trafia ostatecznie na anodę powodując przepływ rejestrowanego prądu. W nowszych konstrukcjach powielaczy elektronowych serię dynod zastępuje się zakrzywioną zwężającą się rurą (powielacz elektronowy o dynodzie ciągłej). Elektrony uderzają wielokrotnie w ściany rury powodując emisję kolejnych elektronów. Powielacze elektronowe są bardzo czułymi detektorami.
3. Detektor mikrokanalikowy zbudowany jest z płytki z niewielkimi (4-25 μm), zakrzywionymi otworami. Powierzchnia otworów pokryta jest półprzewodnikiem mającym zdolność emisji elektronów. Na stronie wejściowej płytki utrzymywany jest potencjał ujemny (napięcie rzędu 1 kV) w stosunku do strony wyjściowej. Jony wpadają do kanalików i zderzają się ze ścianami otworów powodując kaskadową emisję elektronów, podobnie jak w powielaczu elektronowym. Za każdym z kanalików znajduje się metalowa anoda zbierająca elektrony. Sygnał powstały w ten sposób jest mierzony.
4. Detektor fotopowielaczowy — składająca się z dwóch dynod konwersyjnych (jedna dla jonów dodatnich druga dla jonów ujemnych), ekranu fluorescencyjnego i fotopowielacza. Jony wpadające do detektora uderzają w dynodę konwersyjną powodując emisję elektronów. Elektrony są kierowane na ekran fluorescencyjny przy pomocy pola elektrycznego. Po uderzeniu elektronu w ekran emitowane są fotony, które trafiają do fotopowielacza. Fotopowielecz wzmacnia sygnał, który potem jest rejestrowany.
5. Detekcja w analizatorze cyklotronowego rezonansu jonów (ICR) — analizatory ICR są jednocześnie detektorami jonów, nie wymagają one instalacji dodatkowych detektorów.

Zastosowania spektrometrii mas w badaniach biologicznych

Etapem milowym w zastosowaniu spektrometrii mas w badaniach struktury i funkcji białek było wynalezienie metod łagodnej jonizacji. Przy wysokiej dokładności pomiarów wymaga niewielkich ilości i objętości próbki białka. Umożliwia detekcję z dokładnością do pojedynczych aminokwasów (mutageneza, modyfikacje posttranslacyjne, np. fosforylacja).

Jak każda metoda doświadczalna ma ona pewne ograniczenia i wady. Aby uzyskać wiarygodne wyniki próbka musi być idealnie czysta. Z tym wymaganiem łączą się trudności z selektywną analizą mieszanin. W przypadku dużych białek widma są skomplikowane i trudne do interpretacji. Pomimo tych ograniczeń spektrometria mas jest jedna z najbardziej precyzyjnych metod pomiarowych.

Przykłady wykorzystania spektrometrii mas

1. Określenie masy i identyfikacja białek.
2. Sekwencjonowanie białek — technika MS-MS, połączona z chemiczną lub enzymatyczną degradacją cząsteczek białek w celu uzyskania oligopeptydów o masach < 3 kDa, pozwala określić sekwencje białka i ustalić które aminokwasy uległy modyfikacji posttranslacyjnej.
3. Dynamika fałdowania białek — pomiędzy białkami a otoczeniem zachodzi stała wymiana wodorów amidowych. Jej szybkość zależy od struktury białka. Jeśli białko umieścimy w D2O zaobserwujemy wymianę protonu na deuter. W przypadku białka rozwiniętego wymiana wodorów na deuter zachodzi z podobną szybkością dla wszystkich aminokwasów. Dla białek zwiniętych szybkość wymiany zależy od otoczenia wodoru amidowego:
   • ekspozycja wodoru amidowego na solwent — szybka wymiana,
   • zaangażowanie wodoru amidowego w tworzenie struktur lokalnych — wolniejsza wymiana,
   • zaangażowanie wodoru amidowego w tworzenie struktur globalnych (np. alfa-helisa) — wolna wymiana lub jej brak w białku zwiniętym.
   Analiza masowa pokazuje dla których peptydów nastąpiła wymiana proton-deuter — na tej podstawie możemy identyfikować struktury tworzące się podczas fałdowania białek.
4. Identyfikacja stanów pośrednich.
   W metodzie ESI białka zjonizowane w stanie natywnym posiadają węższy rozkład stanów i mniejszy ładunek niż białka zjonizowane w stanie zdenaturowanym. Obserwacja rozkładu [math]\nicefrac mz[/math] w funkcji „stanu zwinięcia” białka pozwala określić czy istnieją stany pośrednie procesu faldowania.
5. Identyfikacja modyfikacji posttranslacyjnych.
   Modyfikacje postranslacyjne takie jak: fosforylacja, glikozylacja, acylacja, tworzenie mostków dwusiarczkowych, izomeryzacja ładunku, odcinanie końców C lub N, lub cięcie białka przez karboksypeptydazy, aminopeptydazy lub endopeptydazy powodują zmianę masy biomolekuł widoczną w widmach MS.
6. Identyfikacja białek po dwuwymiarowej elektroforezie (2-DE).
7. Potwierdzenie prawidłowości syntezy peptydów.
   Synteza peptydów, projektowanie antybiotyków, nietypowych ligandów polega na stopniowym blokowaniu, odblokowywaniu i aktywacji gryp aminowych i karboksylowych w białkach. W trakcie syntezy mogą pojawiać się następujące problemy: delecja peptydów, niekompletne zablokowanie, utlenianie metioniny, trifluoroacetylacja seryny. Zmiany mas z tym związane są widoczne w widmach MS. Na tej podstawie można ocenić jakość wykonanej syntezy.
8. Badania kompleksy białkowych.
   W obecności 5 mM Mg²⁺ zarejestrowano rybosomy 70S. Poprzez obniżenie stężenia jonów magnezu uzyskano dysocjację podjednostki 70S na podjednostki 30S i 50S oraz określono dokładnie ich masy.
9. Analiza kwasów nukleinowych, w tym analiza mieszanin oligonukleotydow i długich łańcuchów kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie DNA.
10. Analiza węglowodorów.
11. Obrazowanie w medycynie.
    Zamrożona tkanka jest cięta na cienkie plastry i umieszczana na metalowej płytce pokrytej materiałem absorbującym UV. Następnie oświetlana jest punktowo (przemiatana) laserem. Na skutek absorpcji energii wybijane są cząsteczki budujące tkankę. W kolejności wybicia cząsteczki analizowane są metodami spektroskopii masowej. Następnie tworzy się mapy masowe tkanki.